Nature Biotechnology.：新型水凝胶可以在几天内发现新的“化学抗体”

　　

宾州大学公园一条双螺旋DNA链可以延伸六英尺，但它是如此紧密地缠绕在一起，以至于它把整个核苷酸序列装进了一个微小的细胞核中。如果同样的DNA被分成两条链，并分成很多很多短片段，它将变成数万亿个独特的折叠3D分子结构，能够结合并可能操纵特定形状的分子——如果它们是完美的匹配的话。

这些短的单链DNA或RNA片段被称为适体，也被称为“化学抗体”。根据宾夕法尼亚州立大学的研究人员的说法，它们在生物医学中作为有益的治疗或诊断试剂出现，特别是在替代生物抗体方面。然而，为目标分子找到完美的适体——例如，抑制癌性肿瘤的p53蛋白——需要从潜在的适体候选者中筛选，这些候选者的数量超过了银河系中恒星的数量。这个过程可能需要几个月的时间，而且往往根本找不到匹配的对象。

宾夕法尼亚州立大学的研究人员开发了一种新方法，使用一种水凝胶——一种聚合物网络，可以保持其形状，当它吸收大量的水时可以膨胀——来保留“高亲和力”或合适的适配体，而其余的适配体候选体在60小时内离开凝胶。该团队昨天(10月5日)在《自然生物技术》杂志上报道了他们的“适体选择水凝胶”(HAS)方法和研究结果。

根据通讯作者、宾夕法尼亚州立大学生物医学工程教授Yong Wang的说法，HAS方法可以降低研究人员探索适体潜力的障碍，适体比抗体更容易修饰，保质期更长，更容易进入组织，在许多生物医学应用中，如再生医学、药物输送、细胞工程、生物成像等。

Yong Wang说：“寻找适配体的过程不仅让初学者感到沮丧，也让经验丰富的研究人员感到沮丧，就像大海捞针一样，”。“许多研究人员对在他们的项目中使用适配体感兴趣，但由于很难获得适配体，他们无法测试他们的想法或探索新的应用。适配体本身可以用作治疗手段，它们可以与药物或纳米颗粒结合以指导递送并提高疗效，它们可以用于使检测试剂盒功能化，以检查血液样本是否含有病毒或癌症生物标志物。基本上，适体可以应用于任何设计抗体的地方。”

该团队的水凝胶由聚乙二醇(PEG)制成，其中包括固定的凝血酶蛋白靶分子，这有助于促进血液中的凝血。一旦将适配体库注入水凝胶，高亲和力的候选体与不移动的目标结合，而不太合适的适配体则通过其孔隙自由扩散，类似于没有挂钩的装饰品如何从圣诞树上掉下来，没有任何东西可以挂在树枝上。

这种扩散方法与传统方法不同，传统方法是将目标分子和适体库混合在溶液中，然后通过薄膜过滤。Wang说，过滤步骤重复了很多次，而好的适体候选人往往会丢失。

“不幸的是，分子结合是一种物理相互作用，在过滤步骤中，特定的候选分子可能会从目标分子中分离出来，穿过膜而丢失，在我们的方法中，如果一个理想的适体候选体从先前结合的靶分子中分离出来，它将重新结合到固定的分子上。因此，在扩散过程中不会轻易失去候选人。”

研究人员通过冷冻混合了丙烯酸的预凝胶溶液来制造多孔水凝胶，丙烯酸随后会与聚合物中的羧基发生化学反应，形成嵌入的凝血酶蛋白，这些蛋白被固定在水凝胶中而不会离开。在这个“冷冻”过程中也出现了冰晶，分散在PEG聚合物网络中，最终在室温下融化并形成水凝胶的孔隙。PEG是“无污垢的”，Wang说，这意味着这种材料限制了适体与水凝胶的不必要的结合，而不像适体与膜的相互作用。

HAS方法还消除了聚合酶链反应(PCR)扩增的需要，这是传统方法的一个步骤，每轮合成一个新的适体库是基于前一个膜中剩余的适体。

“扩增是基于PCR的，它偏向于扩增一些候选基因，而不是平等对待所有候选基因。研究人员发现，这种偏见每次重复都会变得越来越严重，在投入大量时间、劳动力和金钱后，他们可能找不到自己想要的东西。”

作为基线测试，研究人员开发了一种没有嵌入凝血酶的PEG水凝胶，并引入了适体文库，发现60小时后凝胶中几乎没有剩余的适体。这表明非特异性结合——适体与水凝胶结合——的“背景噪声”已经消散，它成为研究人员在测试过程中使用的时间截止点。

收集凝血酶固定化水凝胶中的候选适体，采用新一代测序技术进行分析。研究人员对50个适体候选体进行了优先排序，进一步分类并测试了它们的结合效率。从池中鉴定的“抗凝血酶适体”被发现具有与使用传统方法选择10个周期的适体相媲美的结合亲和力。

“适配体的选择可以在一个步骤中完成，而不需要重复的过程，并且避免了重复操作的所有问题。对HAS方法的进一步研究将对这种方法进行微调，包括为非蛋白靶分子甚至活细胞选择适配体，如果它们可以在环境条件下保存在水凝胶中。“我们希望HAS能帮助研究人员探索需要分子结合或识别的各个领域。”

这项研究的合作者还包括共同第一作者Naveen Singh，他曾是宾夕法尼亚州立大学生物医学工程系的博士后研究员，现就职于印度理工学院德里分校;以及共同第一作者Yixun Wang, Connie Wen, Brandon Davis, Xuelin Wang和Kyungsene Lee，他们都是宾夕法尼亚州立大学生物医学工程博士生。

美国国立卫生研究院资助了这项工作。

文章标题

High-affinity one-step aptamer selection using a non-fouling porous hydrogel