来了！第一份梭梭和白梭梭响应干旱胁迫的全长转录组！

近日，新疆大学干旱生态环境研究所吕光辉教授团队在Frontiers in Plant Science发表文章，该文基于PacBio全长转录本测序（Iso-seq）获得了第一份梭梭和白梭梭响应干旱胁迫的全长转录组，为进一步研究其调控机制奠定了基础。

　　

背景介绍

2022年被称为干旱之年，持续的高温天气引起了世界各地干旱的发生，这将导致农作物产量减产。轻则影响植株生长发育，重则导致植株死亡。

干旱胁迫的分子机制已在阔叶树种中进行了广泛研究，如黑杨、白桦等，但只有少数研究集中在我国西北地区重要的耐旱植物——梭梭（Haloxylon ammodendron）和白梭梭（Haloxylon persicum）。

梭梭和白梭梭是藜科梭梭属植物，具有耐旱、耐高温、耐盐碱土、耐风蚀和耐寒的特性。它们通常在沙漠和半沙漠地区形成大面积纯林，具有固定沙丘和维持生态系统结构的功能，被称为沙漠的守护者。因此揭示梭梭属的耐旱机制对耐旱育种具有重要意义。

近日，新疆大学干旱生态环境研究所吕光辉教授团队在Frontiers in Plant Science发表了题为”Characterization of the gene expression profile response to drought stress in Haloxylon using PacBio single-molecule real-time and Illumina sequencing”的文章，该文基于PacBio全长转录本测序（Iso-form sequencing，Iso-seq）获得了第一份梭梭和白梭梭响应干旱胁迫的全长转录组，为进一步研究其调控机制奠定了基础。

1 技术难点

由于梭梭属具有复杂的遗传背景和庞大的基因组，现有的全基因组序列仍不完整，这限制了对其耐旱分子机制的研究。特别是在新转录本的发现、关键基因的挖掘上存在很大的局限性。

基于二代测序技术虽然也能进行不同转录本的测序，但受读长限制，需要通过外显子拼接位点来推测转录本全貌，无法获得完整的、正确拼接的转录本。因此全长转录本的拼接和注释对二代测序仍是一个难点。

2 解决方案

为了揭示梭梭和白梭梭应对干旱的转录调控网络，研究人员选用了长读长PacBio Iso-seq测序和Illumina RNA测序来进行全长转录本的检测。

3 结果分析

3.1 实验材料

梭梭 (Haloxylon ammodendron)
生长环境：湿润：土壤含水量9.70–15.00%；干旱：土壤含水2.41–4.00%
白梭梭 (Haloxylon persicum)
生长环境：湿润：土壤含水分3.38–5.12%；干旱：土地含水量1.05–3.11%

3.2 测序结果

为探究梭梭属响应干旱胁迫的分子机制，研究人员对干旱和湿润环境下的梭梭和白梭梭进行Iso-seq。梭梭获得了20246576个subreads、435938个CCS reads和35096个单基因，白梭梭获得了908053个subreads、210334个CCS reads和20621个单基因。其中梭梭和白梭梭分别有9404和8426个单基因长达2000-3000 bp，4281和6603个单基因长度超过3000 bp。

表1 SMRT测序结果

注：文中最终的单基因数量根据PacBio和Illumina测序进行相互校正，根据序列之间95%的相似性将校正的转录本进行聚类以消除冗余，最终单基因的数量为15238和10135（表1）。SAB和BAB是干旱和湿润条件下梭梭和白梭梭混合样品的总称。

对于二代测序的难点——简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）和未知长链非编码RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）的检测，要求测序技术需要做到既长且准。而PacBio Iso-seq则正好具备这两个优势：

SSR在真核生物基因组中广泛存在，一般是以1-6 bp组成较低程度的重复序列，主要以2-3个核苷酸为重复单位如(GA)n、(AC)n和(GAA)n等，长度一般在200 bp以下，目前已广泛应用于遗传图谱的构建、目标基因的标定和指纹图的绘制等。由于SSR标记具有较大的应用价值，所以研究人员通过MISA来挖掘梭梭和白梭梭测序数据中的SSR信息。结果表明，从这两个物种的混合样本中分别鉴定出9794和7330个SSR，其中单重复序列丰度最高，其次是三重复序列和双重复序列（图1A，B）。

LncRNAs是一种长度大于200nt的非编码RNA，可用作竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA），参与植物对干旱胁迫的应答，但其仍未被全部鉴定出来。基于PacBio Iso-seq的测序数据，研究人员使用了四种不同的软件（PLEK、CNCI、CPC和Pfam）进行预测，在梭梭和白梭梭中分别得到了838和71个LncRNAs（图1C，D）。这将有助于未来在分子水平上更好地了解梭梭和白梭梭对干旱胁迫的应答机制。

图1 梭梭和白梭梭的SSR分析（A-B）和LncRNA预测（C-D）。
SAB和BAB是干旱和湿润条件下梭梭和白梭梭混合样品的总称。

3.3 抗旱机制分析

植物耐旱性是一个涉及多基因的复杂性状。研究人员分析了干旱和湿润条件下梭梭和白梭梭中参与干旱调节的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），分别鉴定出11803和15217个DEGs。其中，与干旱胁迫信号感知和传递途径相关的DEGs有319和415个，表明Ca2+信号通路、ABA信号通路和MAPK级联信号通路都在干旱条件下发挥重要作用。但二者参与调控的基因在数量和表达模式上有很大差异。

图2 梭梭（A）和白梭梭（B）DEGs热图。x轴代表不同样本中基因的表达量变化；y轴代表基因表达差异的显著性；
表达差异显著的基因由绿点（上调）和蓝点（下调）表示。LS和LB分别代表干旱环境下的梭梭和白梭梭；HS和HB
分别表示潮湿环境下的梭梭和白梭梭。

表2 Ca²⁺信号通路、ABA信号通路和MAPK级联信号通路在干旱条件下受调控的转录因子数目

ZEP：zeaxanthin epoxidase（玉米黄质环氧化酶）；PYL：abscisic acid receptor（ABA受体） ；PP2C：protein phosphatase type-2C（蛋白磷酸酶type-2C）；SnRK2：SNF1-related protein kinase 2（SNF1相关蛋白激酶2）；CaMs：calmodulin（钙调蛋白）；CIPK：CBL- interacting protein kinase（CBL-相互作用蛋白激酶）

植物干旱胁迫应答受复杂的转录因子（transcription factor，TF）调控网络控制。研究发现，干旱条件下梭梭和白梭梭中分别有217个和398个TFs的表达量发生变化，包括高度表达的FAR1、MYB、bZIP、C2H2和AP2/ERF。梭梭中的大多数参与调节的转录因子受上调，白梭梭则相反。

图3 梭梭（A）和白梭梭（B）中与干旱胁迫有关的差异表达的转录因子（选择了前20个差异表达的转录因子）。
LS和LB分别代表干旱环境下的梭梭和白梭梭；HS和HB分别表示湿润环境下的梭梭和白梭梭。

生理指标测定和生物信息学分析表明，干旱胁迫下，二者的活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除、葡萄糖代谢、功能蛋白和木质素生物合成相关基因的表达模式不同，表明由于所处干旱程度不同，梭梭和白梭梭对干旱胁迫具有不同的调节机制和耐旱性。

3.4 梭梭和白梭梭干旱胁迫响应的示意模型

基于测序所得的差异表达基因及其相关通路，研究人员提出了一个梭梭干旱应答模型（图4）。干旱胁迫下，梭梭和白梭梭中大量基因的表达发生了变化，包括胁迫信号敏感基因、抗氧化胁迫基因、功能蛋白基因、木质素生物合成基因和糖代谢基因。

 
图4 梭梭和白梭梭耐旱机制的假设模型。箭头表示正调控，以条形结尾的线表示负调控，虚线箭头既不表示上调也不表示下调。具体耐旱机制如上所示，当受到干旱胁迫的威胁时：（1）植物细胞可以感知胁迫信号，并通过ABA（脱落酸8'-羟化酶、PYL、NCED、PP2C、ZEP、SnRK2、XERICO）、Ca2+（CaMBP、CBL、CaM、CML、CIPK、CDPK、CaBP）和MAPK（MAPK，MAPKK，MAPKKK）级联信号转导相关蛋白激酶基因的调节，将其从细胞外传递到细胞内，然后由细胞核中调节相关基因表达的相关TF（MYB，FAR1，AP2/ERF）转录。（2）TFs促进活性氧清除系统相关基因（APX、CAT、SOD；GPX、GST、POD）的上调，并降低细胞中的活性氧含量，以减少干旱对细胞的损伤。（3）渗透调节相关基因受到细胞核内TFs的调控。β-淀粉酶和ADH1的上调增加了可溶性糖的合成，大分子蛋白质如（AQP和HSP；ASR和HSP）开始大量积累，这可以在一定程度上平衡细胞内和细胞外水势。此外，位于细胞膜上和位于液泡膜上的PIP蛋白也可以调节细胞和液泡中的水平衡。（4）干旱胁迫促进木质素生物合成基因（4CL、β-葡萄糖苷酶、CCOMT、CCR、COMT、F5H、漆酶；β-葡萄糖苷酶、CADH、COMT等）的表达增加，从而增强植物的耐旱性。

综上所述

基于PacBio Iso-seq测序，研究人员在参考基因不完善的情况下获得了第一份关于梭梭和白梭梭响应干旱胁迫的全长转录组，并且通过生理和分子反应的协同作用，解析了梭梭和白梭梭对干旱胁迫的响应。与梭梭相比，白梭梭的生长环境更为恶劣（土壤含水量较低），耐旱性更强。而梭梭则在干旱条件下生长和生理变化更大，反应更快、也更强烈。这些结果为进一步研究植物在干旱胁迫下的适应性机制及育种改良策略提供了基础。

Iso-seq

基于HiFi测序，不仅能揭示由可变剪接带来的转录本多样性，还能用于SSR分子标记、可变聚腺苷酸化、基因注释、融合基因转录本、转录本亚型变异的定相（Phasing）以及LncRNA的分析检测。

tips

该文采用PacBio Iso-seq与Illumina RNA-seq结合是基于2019年前已发表文章的技术路线。由于2019年前PacBio Iso-seq测得的数据不够准确，需要用Illumina RNA-seq数据对PacBio Iso-seq数据进行校正（在HiFi发布前）。事实上，自2019年以单分子实时（single-molecule real-time，SMRT）测序为特点的HiFi测序技术面世以来，PacBio Iso-seq都是基于HiFi测序进行。HiFi测序采用环形一致性（Circular consensus sequencing，CCS）测序，经分子间连续读取校正随机误差后，准确率可达Q30。凭借其既长（最长25 kb）又准（准确度Q30）的优势，即使在没有参考基因组的条件下通过HiFi测序也可以直接获得高质量的全长转录本信息，而无需中断和组装。因此现在基于HiFi测序的Iso-seq无需用二代测序进行校正，仅HiFi测序就能得到全长且准确的Iso-form的序列信息。

基因有限公司

基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。