自动化、高灵敏度的CRISPR基因编辑质控方案

【字体：大中小】 时间：2022年08月05日 来源：

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　　今天的文章将向大家介绍Aglient毛细管电泳技术在CRISPR 基因编辑中对gRNA和ssDNA（单链DNA）模板的质控以及编辑发生后HDR效率评估的应用。

CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas9基因编辑技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今主流的基因编辑系统。CRISPR-Cas9技术包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA （guide RNA）。gRNA与Cas9蛋白形成复合物，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生双链断裂（DSB），引发细胞内部的DNA修复机制（DNA repair）。真核细胞同时存在着HDR（同源重组修复）和NHEJ（非同源末端连接）。

NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制，用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默。对比NHEJ修复途径，HDR 途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点，从而实现基因的敲入。

图1. An overview of CRISPR/Cas 9 mediated genome editing（doi: 10.3390/pharmaceutics13101649）

今天的文章将向大家介绍Aglient毛细管电泳技术在CRISPR 基因编辑中对gRNA和ssDNA（单链DNA）模板的质控以及编辑发生后HDR效率评估的应用。

gRNA质控

gRNA依赖于工程DNA模板的体外转录，利用这一过程合成gRNA可以产生足够的材料进行多次转染。然而，多次冻融、不当处理或污染会使gRNA降解，妨碍高效的基因编辑。所以gRNA的质控是CRISPR基因编辑过程中的重要环节。以下比较了传统琼脂糖凝胶电泳和5200 片段分析仪，对gRNA降解程度和片段大小的检测。

图2.用Agilent 5200 片段分析仪，Agilent HS RNA kit (15 nt) 分别分析不加热、热变性(70℃10分钟)或(90℃30分钟)的sgRNA样品（LP：Linear peak，SSP：secondary structure peak，DG：degradation）

图3.琼脂糖凝胶电泳分离在90℃下降解0、30、60、90、120分钟的gRNA #7。

根据毛细管电泳的结果可以看出，在没有热变性的情况下，sgRNA 分离为147 nt的线性主峰（LP）和543 nt的二级结构峰（SSP）(图2A)。经过热变性的RNA分子其内部二级结构减少，从图中也可以看出二级结构峰下降。与此同时，毛细管电泳能以优异的灵敏度检出70℃变性10min和90℃变性 30 min条件下的轻微gRNA降解（DG）（图2 B、C）。

通过凝胶电泳分离降解的sgRNA ，可以看到两个明显分离的主峰和二级结构峰，但受限于由于传统凝胶电泳的分辨率，没有观察到90℃热变性30分钟后的gRNA的降解，只在经历90℃热变性60和90分钟的泳道中我们才能观察到RNA降解导致的条带拖尾现象（图3）。并且传统凝胶电泳的低分辨率只能估计条带的大小和降解程度，而5200 片段分析仪易于片段可视化和自动分析。

通过以上实验看到琼脂糖凝胶电泳在分析gRNA的质量时，只能确定gRNA是否被大程度地降解，但其分辨率和灵敏度不足，无法检测轻度的RNA降解。此外，RNA琼脂糖凝胶还需要使用甲醛和DEPC等有害物质，需要多个人工操作步骤，给实验人员带来健康风险。Agilent 5200 片段分析仪实现gRNA质控步骤的自动化，无需使用危险的变性剂，同时提供更高的分辨率，能够检测出轻微的RNA降解。

HRD ssDNA模板质控

研究发现，CRISPR/Cas HDR介导的基因敲入过程中，ssDNA模板相较于dsDNA（双链DNA）模板能够大大增加HDR效率。ssDNA模板获取方法：用带5 '磷酸化和不带5 '磷酸化的引物PCR扩增dsDNA模板，再使用链选择性核酸酶处理PCR产物生成ssDNA。ssDNA模板生成需要质量控制步骤，以确保从dsDNA到ssDNA的完全转换。

（1）完全消化的dsDNA鉴定

下图展示利用Agilent 5200毛细管电泳和传统琼脂糖电泳分析未消化dsDNA和选择性核酸酶(TaKaRa, #632644)37℃消化5分钟的电泳结果：两种方法均明确鉴定出预期大小为1000 bp的dsDNA PCR产物和更小尺寸的ssDNA，且均表明该dsDNA被消化为ssDNA终产物，适合用于同源性指导修复。5200 片段分析仪高灵敏度特性使其仍能检测到少量未消化的dsDNA(图4A；蓝色印迹)。

图4. (A)用Agilent CRISPR Discovery凝胶试剂盒在 Agilent 5200 片段分析仪上分析起始dsDNA PCR片段（黑色）和消解后的ssDNA（蓝色）终产物，（LM = lower marker; UM = upper marker）。(B) GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳。

（2）不完全消化的dsDNA鉴定

下图展示利用酶消化1.5分钟来模拟未完全消化的效果，5200 片段分析仪在两次消化中都清楚地识别出未消化的dsDNA和ssDNA终产物(图5A和B)。然而，通过琼脂糖凝胶电泳分离(ssDNA 3和4)，显示片段的尺寸略小于起始的dsDNA PCR产物(dsDNA 3和4)(图2C)。因此，很难确定是否发生了消化，以及最终产物是含有ssDNA、dsDNA，还是dsDNA和ssDNA的组合。

图5. 将dsDNA PCR产物部分消化为ssDNA终产物(A) #3 (B) #4。用Agilent 5200 片段分析仪和Agilent CRISPR Discovery凝胶试剂盒对两者进行分析（LM = lower marker; UM = upper marker）。(C)琼脂糖凝胶电泳分析#3和#4 DNA样品。

5200 片段分析仪提供快速、敏感的长ssDNA终产物分析，用于CRISPR/Cas HDR介导的基因编辑。与琼脂糖凝胶电泳相比，5200 片段分析仪具有更高的分辨率和灵敏度，可以更清晰地了解样品组成和少量剩余未消化的dsDNA，这些有助于研究人员决定样本是否适合下游应用。

限制性内切酶评估CRISPR HRD效率

现在有许多研究者使用HDR修复方式进行基因的敲除，HDR引入的同源片段中含有特定的限制性酶切位点，这种方法既能破坏开放阅读框实现基因敲除，又能不经过单克隆生长和挑选步骤，在混合细胞样本中建立快速量化编辑效率的体系：

1 通过敲除位点两端的特异性引物，PCR扩增编辑位点；
2 使用限制性内切酶处理扩增子，只有包含HDR事件的扩增子才会被酶切；
3 基因编辑效率等于HDR事件百分数即酶切效率。

理论上的HDR效率计算公式如下：

分别用5200片段分析仪（Agilent CRISPR Discovery凝胶试剂盒）和2%琼脂糖凝胶电泳对酶切后的片段进行分析。

结果显示30个PCR循环下能有效检出酶切后的片段和同源双链分子，但是还发现了PCR扩增过程中产生了高比例的异源双链分子，这会影响内切酶的可及性，使得对HDR事件的评估不准确。因此将PCR循环数减少为15来改善这一情况，得益于毛细管电泳的分辨率和灵敏度，仍能有效检出被酶切的片段、同源双链分子以及极少量的异源双链分子，增加了HDR事件量化的准确性。安捷伦片段分析仪甚至能够有效检出低至6%的HDR事件。

图7. 已知pHDR比例为40%的模板，30（左）和15（右）个PCR循环扩增后酶切的毛细管电泳结果

而琼脂糖电泳受限于灵敏度和分辨率，即使30个PCR循环扩增后，只有含40%的pHDR模板（含有酶切位点的模板）才能被检测到酶切片段，并且无法区分同源和异源双链（图8）。

图8. 已知pHDR比例（分别为6%、12%、25%和40%）的模板30个PCR循环扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果

综上，Agilent 5200 片段分析仪能在混合细胞样品中进行基因分型评估HDR的比率，ProSize软件上的CRISPR插件自动计算酶切百分比，从而快速量化编辑效率。5200 片段分析仪系统的高分辨率使同源和异源双链分离，有助于优化PCR条件，限制混合模板PCR过程中异源双链的形成。此外，与琼脂糖凝胶电泳分析相比，5200 片段分析仪系统的高灵敏度，可以检测低水平的HDR事件，减少了筛选样品的时间。

Agilent Fragment analyzer 基于阵列式毛细管电泳的原理，为DNA和RNA的定性或定量分析提供简便的无需值守的自动化流程，可自动完成灌胶、上样、电泳和分析，可获得核酸片段分布、分子量、浓度、片段含量百分比等信息。