中国力量抗击新冠 - 荧光偏振法进行高通量 PLpro 抑制剂筛选

　　

COVID-19 的全球传播是对公共卫生的严重威胁，有效的治疗方法仍然非常有限。因此，新型抗病毒药物的发现是抗击新冠肺炎最为迫切和紧要的任务。

在 COVID-19 的致病病原体 SARS-CoV-2 的生命周期中，木瓜样蛋白酶 (PLpro) 在新病毒颗粒的成熟和释放中起作用，并能抑制 Ⅰ 型干扰素的产生，同时逃避疫苗的免疫。因此，PLpro 被认为是开发抗病毒药物的一个非常有吸引力的靶点。阻断了 PLpro ，这种病毒的产生就会受到抑制，同时人体细胞的先天性免疫反应也会增强。

SARS-CoV-2（之前称为 2019-nCoV）的透射电镜图，
图片来自 NIAID RML。

近期皖南医学院陈云雨教授带领的团队，开发了一种强大而简单的三明治状荧光偏振 (FP) 筛选方法，用于 PLpro 抑制剂的发现。

通过实验，该团队确定了盐酸是体外靶向 PLpro 的竞争性抑制剂，IC50 值达到 24.26 ± 0.4 μM 。因此，这种强大、简单、可靠的 FP 筛选方法对于快速筛选靶向 PLpro 的抗病毒药物至关重要，并可能为发现病毒蛋白酶抑制剂提供一个非常有前景的筛选途径。该项研究成果近期将发表于 Virology 杂志。

原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682222001118

三明治筛选结构设计：

参考该课题组相关文献方法报道，研究团队通过巧妙地设计，构建荧光探针 FITC-S-Biotin （FITC-AVLQSGFRKK-Biotin ，下图紫红色虚线）作为 FP 示踪剂 Tracer ，该 Tracer 具有三明治样结构：中间包含了 PLpro 蛋白酶（下图的剪刀）的酶切位点，一端偶联了 FITC 荧光探针（下图绿色圆形），另一端是 Biotin ，可以与蛋白 Avidin （下图红色新月形）特异性结合，形成分子量较大的结构。

当存在活性抑制剂（下图蓝色六边形）阻断 Mpro 酶切功能时，未被 Mpro 切割的 Tracer 具有较大的荧光偏振值；当存在 PLpro 蛋白酶及非活性抑制剂（下图棕色六边形），Tracer 被切断，FITC 端释放成为小分子，荧光偏振值下降。利用该体系，可筛选具有抑制 PLpro 酶活性的化合物。

该高通量筛选试验的操作分为 4 个步骤，供实验室使用。如图 A 所示，整个过程每轮筛选耗时约 70 min 。首先，将含有 1 个  μM PLpro  (29 μL/孔) 和 1 个天然产物 (2 mg/mL, 1 μL/孔) 的 30 μL 反应混合物室温孵育 30 min ，随后加入 20 μL FP 探针溶液 (30 nM) ，室温孵育 30 min ，再用 10 μL 亲和素溶液 (240 nM) 进行 5 min 的反应，用酶标仪测定 mP 值。

为了快速可靠地筛选天然产物，每个筛选微孔板的排列应如图 B 所示，阳性 (GRL0617) 、阴性 (DMSO) 和背景对照应包含在每个筛选周期中。经过筛选和验证，确认盐酸为 PLpro 的有效抑制剂。然而，anacardiacid具有细胞毒性，需要进一步的化学修饰和结构优化来提高其靶标特异性，降低其细胞毒性。

在本研究中，作者首先应用 FP 技术开发了一种优化的三明治状 FP 筛选方法，用于 PLpro 抑制剂的发现。该方法在高通量筛选（ HTS） 应用中显示了稳定性高、便捷和低成本的优势。

与已发表的生化分析相比，这种 FP 筛选试验是非常简单和快速的，4 步筛选程序每个筛选周期只需要 70 min 。此外，在此 FP 筛选试验中只使用了微量肽底物 (FP 探针，10 nM/孔) ，与 RFU 信号相比，mP 值的监测指标较为稳定。因此，该方法具有操作简单、效率高、重现性好、成本低廉等特点，适用于 HTS 筛选。

此外，由于在此 FP 筛选试验中 FITC 的发射波长为 535 nm ，天然产物自身荧光对筛选试验可靠性的干扰最小。因此，该方法有望获得可靠的结果，并将在 PLpro 靶向抗病毒药物的筛选和评估中具有广泛的应用价值。

◇ FP 小知识：

荧光偏振 (FP) 检测技术是一种以荧光标记的检测技术，它把荧光物质标记在特定物质上，使原本微弱的反应信号转化成较强的荧光信号，起到信号增强的作用。与此同时，在检测系统中加上起偏器和检偏器，当从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光，样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光，此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度。通过荧光强度和样品浓度制作工作曲线，就可以定量分析了，极大提高了方法的灵敏度和特异性。

荧光偏振 (FP) 检测技术不需要分离游离和结合的示踪物，减少了研究人员的工作量，所有检测都可以在溶液中进行，具有快速、灵敏度高、特异性好、操作省时简便的优点。荧光偏振技术在 受体 /配体研究（如激素/受体检测），蛋白质 /多肽相互作用，DNA/蛋白质相互作用，酪氨酸激酶检测，竞争性免疫检测等分子互作技术中得以广泛应用。

◇ FP 检测仪：

根据荧光偏振检测和高通量筛选的需求，多功能酶标仪成为了 FP 检测的理想仪器。高灵敏度荧光检测模块并配合荧光偏振检测的专用配件，即可实现 96-1536 孔板的快速检测，同时还可以配合叠板机来实现自动化高通量的检测流程。

Agilent BioTek 多功能微孔板检测系统，功能强大应用广泛，作为部分功能模块可以为用户提供优质的荧光偏振检测结果。上文中所有 FP 检测结果均来自于 Agilent BioTek Cytation5 多功能酶标仪。BioTek 也始终和中国科学家一起，共同为抗击新冠，服务科研而不懈努力。

Cytation5多功能酶标仪

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