植物合成生物学新启动子文库筛选

合成代谢工程在利用植物作为生物反应器生产治疗性蛋白质或代谢物方面显示出很大的前景。然而，大多数代谢工程启动子的选择是经验的，这需要它们的定量表征。目前，中国科学家已经成功地研究了一个启动子文库，该文库可用于植物基因表达的最佳调控。他们还成功地设计了β蛋白酶通路，以证明使用这些启动子的可行性。

　　

植物科学家正在积极努力成功地将有价值的性状引入植物中，并将它们用作“分子嫁接”的生物反应器，即在充当化学工厂的活生物体中生产药用有用的分子。产生的分子包括重要的治疗蛋白，这些蛋白可以通过改变植物的合成开关或代谢途径在植物中表达。像DNA启动子和终止子这样的基因元素对创建这个平台至关重要，因为它们控制着“感兴趣基因”的表达。虽然大多数启动子特性研究通常使用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因分析来分析启动子强度，但使用双荧光素酶报告基因系统的“双荧光素酶”分析似乎是更好的替代方法，因为它具有比例性、敏感性和产生较少的背景噪声。

为了重新连接代谢网络，多个基因必须在不同的启动子(dna区域)下表达，从而触发特定基因的表达。这可以防止所有可能导致代谢失衡的基因同时过表达。因此，科学家努力追求“最佳基因表达”，即启动子的选择是基于定量评价，而不是通常的经验选择。由于修改植物基因组内容具有挑战性，需要更实用和合理的合成生物学方法来定量评估启动子和使用它们。

为了解决这些知识上的空白，来自中国的一个研究团队使用了一种系统的方法来筛选启动子和终止子库，并在报告分析中对它们的性能进行临时评估。利用这些启动子对烟草亲缘植物本thamiana的甜菜蛋白酶途径进行了构建。这项研究由中国科学院植物生理生态研究所的王勇教授和李建华博士领导的团队进行，研究结果发表在6月1日的《生物设计研究》杂志上。

研究人员使用了来自多种植物和病毒的启动子序列，包括拟南芥、玉米、马铃薯、水稻和感染植物的逆转录病毒。首先，他们在木薯叶脉花叶病毒的P_CsVMV启动子下克隆了GFP报告基因，创建了一个单一表达载体。接下来，他们构建了雷尼拉荧光素酶(R-luc)基因由P_CsVMV启动子驱动，萤火虫荧光素酶(F-luc)基因由一系列19个独立启动子驱动的双表达载体。将这些构建物渗透到本氏芽孢杆菌叶片中，也转染到烟草BY21细胞或悬浮培养中。在包含GFP和荧光素酶的两个报告基因检测中，P_CsVMV在所有测试启动子中显示出最高的活性。利用mrna -蛋白相关性对结果进行验证，其中R-luc/F-luc的相关性优于GFP，表明其更可靠、更准确。“我们证明了不同强度的多个启动子序列对通过精确控制基因表达调节代谢通路是必要的，”王教授说，强调了他们研究的主要发现。

在13个终止子序列中，拟南芥的T_AtHsp18.2终止子表现优于常用的T_35S和T_nos终止子。为了了解他们选择的终止子和启动子是如何共同影响基因表达的，研究人员评估了105种终止子-启动子组合，发现表现最好的组合(P_CsVMV/T_AtHsp18.2)和表现最差的组合(P_AtRD29B/T_nos)的表达可能相差多达326倍!王教授解释说:“这凸显了为最佳转基因表达选择正确的组合是多么重要。”

为了让他们的发现得到强有力的支持，他们继续使用甜菜蛋白酶合成途径在植物中提供了一个概念证明。他们使用“甜菜素”作为代谢目标，因为它是甜菜根和仙人球等水果中发现的一种红色色素，可以直观地指示基因表达。与他们的推测一致，研究人员发现，当两个关键通路基因CYP76AD1和DODA由最强启动子P_CsVMV驱动时，甜菜蛋白酶的产量并没有达到最高。相反，最大beta素产量的最佳组合是P_CsVMV和P_AtUbq10，它们一起发挥了神奇的作用。

结果表明，定量表征的启动子可以确保基因的最佳表达。这是可能的，如果基因转录可以定义在一个周到的和控制的方式。王教授解释说:“设计导向的理性工程对于创造最佳解决方案非常重要。我们的研究不仅证明了多个启动子序列的不同强度，而且为植物代谢工程增加了植物启动子库。”