PNAS：新型荧光cAMP指示器有助于神经元活细胞成像

环磷酸腺苷(cAMP)是一种重要的信号分子。然而，提供细胞内cAMP动态清晰视图的探针还有待开发。现在，同志社大学的科学家们创造了一种新型的cAMP特异性荧光指示器，称为gCarvi，它可以显示神经元中cAMP的浓度。他们发现，使用gCarvi揭示了cAMP在分子信号通路中的多层面作用。因此，gCarvi可能是一个强大的工具来确定几个神经元功能下的cAMP动态。

　　

   

   

图:cAMP/Ca2+之间的交叉调节是神经元的基本现象。然而，我们不知道cAMP动态的精确细节。现在，来自日本的研究人员开发了一种新的荧光cAMP指示器，它为神经元交流带来了宝贵的见解。    

环磷酸腺苷(cAMP)是一种胞内信使分子，负责包括神经元在内的许多细胞的功能，促进轴突的生长，维持神经元间的通信。cAMP的分子途径已得到充分研究，已知它在调节突触功能中发挥重要作用;然而，能够精确监测其细胞内活动的指标还有待开发。

现在,Naoto Saitoh带领的研究团队通过开发一种新型绿色荧光cAMP指示器gCarvi解决了这个问题。它们的指标可以很容易地用腺相关病毒载体表达，并能够定量测量cAMP的基础浓度(称为[cAMP])。_我)在神经元细胞内。“我们的新指标，gCarvi，监测[cAMP]_我在0.2 ~ 20 μM的浓度范围内，具有亚秒级的时间分辨率，比cGMP具有更高的特异性。它的亮度足以监测单细胞甚至单个突触前钮扣中的cAMP动力学。”斋藤博士解释道，他是这项研究的通讯作者。这篇论文于2022年7月6日在线公开。

一个理想的cAMP指标必须跨越整个细胞内cAMP浓度范围，对cAMP表现出比其他核苷酸(如环鸟苷一磷酸(cGMP))更高的特异性，cGMP也负责突触调节，不干扰内源性cAMP途径的生理功能，并能够稳定的细胞内成像。在哺乳动物中，现有的大多数cAMP指标都包含cAMP结合域(CBD)的调控亚基。然而，这些亚基是内源性分子，使用它们可能会破坏cAMP通路的生理功能。gCarvi克服了这个问题，因为它含有一种细菌cAMP受体蛋白的CBD，不干扰哺乳动物细胞中的cAMP通路。

研究人员将细菌CBD与一个环状排列的绿色荧光蛋白(cpGFP)融合，cpGFP通过与之结合时发出的荧光强度的相应变化来检测cAMP浓度。此外，gCarvi被发现可以弥补现有cAMP指标在阻止cGMP检测方面的另一个缺陷，其表现出>100的高cAMP/cGMP特异性，但与cGMP的亲和力较低。

研究组将gCarvi与红色荧光蛋白mCherry融合，开发出了能够检测不同浓度cAMP的比率探针。该探针在海马神经元中表达，以监测[cAMP]的变化。_我 作为概念的证明。 同样，gCarvi与红色荧光钙离子(Ca^{2 +})指示器检测cAMP和Ca^{2 +}两者都在神经元调节中发挥作用。

同时检测cAMP/Ca^{2 +}发现cAMP和Ca之间有很强的联系^{2 +}信号。福斯柯林是一种能提高cAMP水平的化合物，经福斯柯林和磷酸二酯酶(PDE)抑制剂处理后，在这些神经元中观察到细胞内cAMP增加超过一定阈值，从而导致Ca^{2 +}海拔高度。类似地，在小脑突触前扣中，forskolin被用来诱导不规则的cAMP升高，这表明突触小泡循环的数量正增加。这表明在单个钮扣中存在突触前cAMP域，它通过划分信号通路来避免串扰来提高突触强度。

谈到这种新指标的未来应用，斋藤博士说”gCarvi可以精确地检测到cAMP信号在大脑中的降解时间，这导致了神经退行性疾病，如阿尔茨海默病。在活体神经元成像中，carvi可以作为一种筛选工具来监测针对此类情况的药物的结果。此外，荧光探针有助于探测细胞中不可见的分子动力学;因此，gCarvi cAMP指标提供了关于神经元交谈的宝贵知识。”  

gCarvi的未来肯定是光明的!

文章标题

Green fluorescent cAMP indicator of high speed and specificity suitable for neuronal live-cell imaging