长征医院研究团队首次发现AMTB在骨肉瘤中发挥抗肿瘤作用

　　

骨肉瘤（osteosarcoma）是第二大常见的原发性恶性骨肿瘤，多发于10-25岁青少年。此类肿瘤会引发疼痛和肿胀，手术和化疗仍是骨肉瘤的主要治疗方法。不过，近年来骨肉瘤的研究未取得很大进展，并且，复发或转移性骨肉瘤患者的预后较差。因此，寻找新的治疗靶点具有重要的意义。

最近，海军军医大学附属长征医院肖建如教授领导的研究团队发现TRPM8是骨肉瘤中一个潜在的治疗靶点，并首次证明TRPM8拮抗剂AMTB具有抗肿瘤作用，可增加肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性。这项研究成果发表在《Cell Death & Disease》杂志上，有望为骨肉瘤的治疗开辟新思路。

研究材料

体外实验在骨肉瘤细胞系上开展，包括U2OS、143B、MG63和HOS。同时，研究也使用了间充质干细胞（MSC，相关培养基由赛业生物提供）。体内实验则在雌性裸鼠上开展。研究人员将骨肉瘤细胞注射到裸鼠背部，开发出骨肉瘤的临床前实验模型。

技术方法

在评估AMTB对骨肉瘤细胞的作用时，研究人员开展了多个实验来评估细胞的增殖、迁移和凋亡能力，包括MTT分析、集落形成实验、Transwell实验、伤口愈合实验等。他们还采用RNA测序和通路富集分析来探索AMTB的潜在作用机制。

技术路线

研究结果

TRPM8表达量在骨肉瘤中上调

TRPM8属于TRP蛋白超家族，是一种非选择性的阳离子通道。自从在前列腺癌中首次发现以来，TRPM8在多种癌症中过表达，并进一步促进了肿瘤发生和肿瘤进展。最近的研究还发现，TRPM8在铂类化疗药物诱导的神经病变中具有重要的作用，在药物治疗后可观察到TRPM8的上调。AMTB是一种TRPM8特异性拮抗剂，能够抑制某些癌细胞的增殖和迁移。为此，研究人员深入探索了AMTB对骨肉瘤的影响。

首先，利用Western blot分析，研究人员发现TRPM8在四种骨肉瘤细胞系（143B、U2OS、MG63和HOS）中过表达。而且，大多数人类骨肉瘤样本呈TRPM8阳性，且TRPM8表达与患者预后呈负相关。这些结果表明，TRPM8在骨肉瘤细胞系和骨肉瘤样本中均上调，TRPM8的表达量可用来预测患者预后。

AMTB抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移

由于AMTB是TRPM8的特异性拮抗剂，研究人员采用AMTB来处理U2OS和143B细胞，并评估细胞的增殖和迁移能力（图1）。经过AMTB处理后，骨肉瘤细胞的集落形成能力减弱，并且集落的数量和大小均以剂量依赖性方式减少。在MTT分析中，AMTB对骨肉瘤细胞表现出抗增殖作用。此外，transwell实验和伤口愈合实验的结果也表明，AMTB处理后的骨肉瘤细胞迁移能力受损。TRPM8是骨肉瘤细胞增殖和迁移所必需的，因此AMTB通过干扰TRPM8的功能而抑制骨肉瘤的进展。进一步的分析表明，AMTB能够诱导骨肉瘤细胞的凋亡。

图1. AMTB在体外抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移

AMTB抑制TGFβ信号通路

为了揭示AMTB发挥抗肿瘤作用的潜在机制，研究人员对AMTB处理后的U2OS细胞进行RNA测序分析。通路富集分析的结果表明，药物处理后显著下调的基因富集在TGFβ通路上，研究人对这一结果进行了后续的验证。

在不同浓度的AMTB处理后，TGFβ以及相关靶点的转录水平明显下降。而且，他们还发现，AMTB能以剂量依赖性方式抑制Smad2和Smad3的磷酸化，而这两种蛋白质的磷酸化在TGFβ信号传导中起关键作用。随后，TGFβ的添加又将Smad2和Smad3的磷酸化恢复到本底水平（图2）。这些结果证实，AMTB通过抑制TGFβ信号传导的激活而发挥抗肿瘤作用。

图2. AMTB通过抑制TGFβ信号通路而发挥抗肿瘤作用

AMTB可增加骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性

顺铂（cisplatin）是治疗骨肉瘤时最常用的化疗方案之一。研究人员采用不同浓度的AMTB和顺铂来处理骨肉瘤细胞。与单独使用高剂量顺铂相比，AMTB与低剂量顺铂的联合使用表现出更强的抑制作用。

之后，在骨肉瘤的临床前实验模型上。体内实验的数据表明，与单独使用AMTB或顺铂相比，AMTB与顺铂联用的效果更好，能够有效抑制肿瘤细胞生长。综合体外和体内实验的结果，研究人员的结论是AMTB可增加骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。

研究结论

总的来说，这项研究揭示了TRPM8在骨肉瘤中上调，且TRPM8的表达水平与患者的预后呈负相关。作为TRPM8的特异性拮抗剂，AMTB能够在骨肉瘤中发挥抗肿瘤作用，并且在体外和体内增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性。在机理上，AMTB通过抑制Smad2和Smad3的磷酸化而抑制TGFβ信号传导，从而发挥其抗肿瘤作用。

原文检索

Liu, Y., Leng, A., Li, L. et al. AMTB, a TRPM8 antagonist, suppresses growth and metastasis of osteosarcoma through repressing the TGFβ signaling pathway. Cell Death Dis 13, 288 (2022). https://doi.org/10.1038/s41419-022-04744-6