高通量CAR-T细胞功能验证新方法

CAR-T细胞疗法是近年来推出的新型精准靶向肿瘤治疗技术，通过对患者T细胞进行基因改造，使其更有效的识别和杀伤肿瘤细胞。目前需要一种快速的、准确的、高通量的方法来质控体外改造的T细胞杀伤肿瘤细胞的效力。

本文向大家介绍一种基于微流控微滴技术进行CAR-T细胞功能验证的新方法。该方法结合了英国Sphere Fluidics公司的微流控微滴技术以及Granzyme B(颗粒酶B)测定来研究CAR-T细胞介导的细胞毒性。细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，可以通过T细胞释放的颗粒酶B来进行评估。该方法能快速评估肿瘤治疗细胞产品的功效，从而简化细胞产品的的QC放行。

图1 微流控微滴中高通量的CAR-T细胞功能验证的工作流程

微流控微滴技术

微流控微滴技术已经成为极具吸引力的单细胞功能分析技术，与传统方法相比具有多种优势。微滴提供了一个独一无二的微环境，在这个微环境中可在单细胞水平上对细胞分泌产物和细胞间互作进行高通量分析。几百皮升的体积有助于快速混合样品，减少样品稀释，提高检测灵敏度，减少样品需求和反应时间。

微滴中颗粒酶B的检测原理

使用适用于微滴的市售颗粒酶B测定试剂盒(SensoLyte® Granzyme B Activity Assay Kit, Anaspec, Fremont, CA)检测微滴中颗粒酶B的释放。该测定基于颗粒酶B底物肽的断裂，用5-FAM荧光团和QXL®-520荧光团猝灭剂标记。在完整、未断裂的状态下，由于附近QXL®-520分子的猝灭效应，激发荧光团时不会发出荧光(图2A)。在颗粒酶B的存在下，肽底物断裂，释放淬灭分子，并产生荧光信号(图2A和B)。

图2  颗粒酶B检测原理。A)用5-FAM（绿色星号）和QXL®-520荧光基团淬灭剂（灰色星号）标记的颗粒酶B底物肽。由于从5-FAM到QXL®-520（左侧）的荧光共振能量转移(FRET)，在激发时未检测到荧光。用颗粒酶B断裂时，猝灭分子被去除，5-FAM发出荧光（右侧）。B)颗粒酶B活性测定在CAR-T细胞/靶细胞相互作用中的应用。左图：CAR-T细胞和非靶细胞，没有CAR介导的信号，颗粒酶B不释放，5-FAM荧光猝灭。右图：CAR-T细胞与靶细胞的相互作用产生CAR介导的信号，颗粒酶B释放，底物肽裂解，猝灭剂释放，检测到5-FAM荧光信号。

微滴中的颗粒酶B检测

为了证明该测定方法的可行性，使用Sphere Fluidics公司的Picodroplet Single Cell Encapsulation System(单细胞微滴包裹系统)生成两群体积约为450皮升的微滴。一群仅含有荧光颗粒酶B底物肽(阴性对照)，另一群将重组颗粒酶B与底物肽一起共包裹。图3显示了两群微滴在37ºC下孵育2小时后在明场(左)和绿色荧光场(右)下成像结果。只有含有颗粒酶B和底物肽的微滴(底部)在孵育2小时后显示出清晰可检测的荧光，而仅含有底物肽的微滴(顶部)仅显示非常低或没有荧光。

图3 使用荧光5-FAM/QXL®-520底物肽检测微滴中的颗粒酶B活性。2小时后的明场（左侧）和荧光场成像图（右侧）。
比例尺：100 µm

T细胞和靶细胞进行颗粒酶B检测实验

将CAR-T细胞、表达PSMA(前列腺特异性膜抗原)的靶细胞(PC3-LN3-PSMA)以及荧光颗粒酶B底物肽共包裹。使用内部定制的生物芯片，带有两个独立的进样口，保持CAR-T和靶细胞在共包裹前处于分离状态。通过调整细胞浓度，使只有约20%的微滴含有CAR-T细胞，大于75%的微滴中包含至少一个靶细胞(根据泊松分布)。因此，约15%(0.75x0.2)的微滴含有至少一个CAR-T和一个靶细胞。在生成的100万个微滴中，有15万个将包含一个CAR-T细胞和至少一个靶细胞。将CAR-T细胞与PSMA不表达的PC3-LN3细胞以及荧光肽底物共包裹作为对照。将微滴收集在EP管中，2、4和24小时的孵育后使用荧光显微镜成像检测颗粒酶B的活性。图4显示了含有PC3-LN3对照细胞(上)和PC3-LN3-PSMA靶细胞(下)的微滴荧光显微图像，分别在2、4和24小时后成像(从左到右)。含有PC3-LN3对照细胞的微滴2、4小时后显示出非常小的颗粒酶B活性。在具有PC3-LN3-PSMA细胞的微滴中检测到多个荧光信号，表明CAR-T细胞响应一个或多个靶细胞而释放颗粒酶B。在长时间孵育(24小时)后，在阴性对照中也观察到荧光增加，这可能是由于非特异性刺激或颗粒酶B从死亡或凋亡的CAR-T细胞中渗出所致。

图4 CAR-T和靶细胞(下)或对照细胞(上)共包裹的微粒颗粒酶B试验。2、4和24小时后微滴的荧光图像(从左到右)。
比例尺:100 µm

使用Cyto-Mine®检测颗粒酶B

在确定5-FAM/QXL®-520荧光肽底物可以检测到CAR-T细胞释放的颗粒酶B后，使用Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine®进行颗粒酶B阳性微滴的检测和分选。使用单细胞微滴包裹系统将CAR-T细胞、PC3-LN3-PSMA靶细胞和5-FAM/QXL®-520肽底物共同包裹在450pL大小的微滴中。

将微滴重新上样到Cyto-Cartridge®中，在仪器内部于37ºC下孵育1小时和2小时后，检测荧光信号。图5显示了在指定时间点获得的微滴大小(y轴)与绿色荧光(x轴)的散点图。在最早的时间点(t=0)，只有1.25%的微滴中可检测到清晰的荧光信号。在2小时后阳性微滴比例增加至2.95%。由于只有15%的微滴同时含有CAR-T细胞和至少一个靶细胞，所以实际阳性率达到20%。之后继续分选这5,000个微滴，分选后，从仪器中取出Cyto-Cartridge®并将其置于荧光显微镜下，对分配室中的微滴进行成像。

图5 利用Cyto-Mine®检测微滴中颗粒酶B的活性。显示在t=0 (A)、 1h (B)和2h (C)时微滴大小(纵坐标)
与荧光信号(横坐标)的散点图。B、C图上多边形框用来确定阳性微滴百分比。

图6显示了Cyto-Cartridge®分配室中微滴的明场(左)和荧光显微成像图(右)。荧光微滴富集是十分明显的。使用ImageJ软件进行分析，Hough Circle算法计数1,112个微滴。其中170个被认为几乎不含荧光(即假阳性，基于接近背景信号和微滴边界较暗)；因此，942个微滴(约85%)为真阳性。分选前仅有2.95%微滴呈阳性，分选后阳性微滴高达85%，相当于进行了28倍的富集。

图6 分选后的微滴在分配室中明场图像(A)和荧光场图像(B)。标尺100 µm

总结

基于Cyto-Mine微流控单细胞分析分选技术，研究者可以在细胞共培养的早期监测 CAR-T细胞活力情况。将CAR-T细胞、靶细胞以及颗粒酶B底物肽共包裹，检测CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性的方法给开发对患者影响大且功能强的细胞产品的实验人员提供了有力的帮助。这种方法能够快速高通量的进行单细胞水平的筛选，快速确定CAR-T细胞的肿瘤杀伤效力并将其中的阳性细胞进行分选，对细胞治疗方法的开发具有重要应用价值。
除此之外，细胞疗法开发人员还可以利用微滴共包裹技术来确定细胞适应性和细胞毒性。批量培养的T细胞表达出多种表型和代谢亚群，单细胞水平上研究其中每个T细胞的毒性效应能够更有效的认识这些亚群，并指导T细胞工程向更有效的亚群发展。微滴共包裹技术也可以快速筛选CAR/TCR基因修饰的候选细胞用于药物开发。

高通量微流控单细胞分析筛选平台Cyto-Mine

基因有限公司2019年正式签约Sphere Fluidics公司，正式成为其中国区代理商。基因有限公司秉承 “基因燃亮生命，生物技术连接世界”的理念，为国内的相关用户提供专业的销售，安装培训，技术支持，应用培训及售后维护等工作。