简介 间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）为基础的组织再生方法因其具有自我更新、多分化潜能以及免疫调节特性，在过去的十年中得到了广泛的应用。 骨髓间充质干细胞的主要优点是其在急性和慢性疾病的临床相关数量方面的迅速可用性( 1). 在治疗前，骨髓间充质干细胞可以在体外扩增数倍以上。
( 1) 然而，广泛的传代培养已被报道导致MSC形态、迁移和分化潜能的基本丧失，细胞骨架的更新减少，线粒体的形态受损，最终增加其衰老的易感性( 1– 三). 除了体外复制性衰老外，研究人员还对来自老年人的骨髓间充质干细胞是否能提供与年轻人相同的治疗效果，从临床和翻译的角度来看，也很感兴趣。 系统水平分析的结果表明自然老化对MSCs的质量和效力有不利影响，从而阻碍了大量MSCs用于自体移植( 1, 4– 9). 此外，在频繁取样方面的局限性阻碍了同种异体骨髓间充质干细胞在多个给药机构中的可用性( 1, 9).
老龄化增加了患病的风险，加剧了受伤和创伤造成的损害。 随着年龄的增长，干细胞池逐渐减少导致MSC数量减少和功能恶化。 以上的陈述是基于之前的一些报告，这些报告提出了老化对骨髓（BM）、脂肪组织（AT）、牙周膜（PDL）和牙髓 （DP）的MSCs数量和质量的不利影响( 6, 10– 21). 因此，临床试验中与老化间充质干细胞显式检测相关的数据匮乏，阻碍了老年人基于细胞的治疗方法的设计。 由于老年人群是以细胞为基础的治疗的主要目标，因此有必要采取可重复的策略来补充足够数量的具有临床能力的骨髓间充质干细胞，并对其进行严格的评估。
牙龈间充质干细胞因其易于组织获取、细胞产量丰富、供区愈合快等优点而受到广泛关注( 22– 27)。 然而，对其衰老及其对干细胞功能的影响的报道很少。 因此，为了将牙龈组织源性MSCs（GMSCs）用于骨再生和免疫调节等再生治疗，我们提出了一些关键问题：（i）供者年龄是否影响人GMSCs的体外生长和表型特征？ （ii）老化对GMSC的功能特性有何影响，包括其多系分化潜能？ （iii）供体年龄是否影响脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤动物模型中GMSCs的体内外免疫调节和再生能力？ 基于这些考虑，我们研究了GMSCs的生物学特性与供体年龄的关系。 与之前的几项有关骨髓基质、AT、PDL和DP的研究报告MSCs的质量和数量均随年龄而下降，我们的数据显示供者的年龄并不影响GMSCs的所有性质( 4, 10, 11, 13, 16, 20, 21, 28– 36). 对体外细胞形态、表面标志物、增殖能力（集落形成和群体倍增）、衰老标志物[衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p53和CDKN2A]和细胞迁移的详细分析表明，供体年龄的增加不会使GMSC的数量和质量恶化。 此外，GMSCs表现出向神经元谱系的倾斜分化，这不受年龄的影响，但观察到脂肪和成骨谱系的减少。 此外，我们还观察到GMSCs在LPS诱导的急性肺损伤（ALI）模型中的体内外免疫抑制行为与供者年龄无关。
结果 生长和表型特征 GMSCs的体外生长和表型特征与供体年龄无关 为了确定供体年龄对体外GMSC群体生长和表型特征的影响，我们对所有年龄组的GMSCs进行集落形成、增殖、群体倍增和MSC表面标记物表达的影响。 A、B、C组的GMSCs在原代培养时呈可塑性贴壁成纤维细胞形态，与供者年龄无关（传代0）( 图1，A和C到E). 这些细胞即使在长期的体外培养（第8代和第12代）中也能保持成纤维细胞的形态( 图1，F至K). 在细胞增殖方面，用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑（MTT）法进行比较分析，发现不同年龄组的GMSCs无明显差异( 图1B). 我们观察到所有年龄组的GMSCs都能有效地形成集落，尽管A组GMSCs的菌落较大( 图1，L到N和Q). 克隆形成效率反映了干细胞的克隆潜能。 然而，C组GMSCs的群体倍增时间（PDT）在高代时显著增加，而第9代和第13代之间的倍增时间减少( 图1，O和P分别为）。 C组大鼠骨髓间充质干细胞PDT升高可能与体外复制性衰老有关。 以上结果支持先前的报告，即供体年龄不会降低早期传代过程中牙干细胞的体外增殖行为 ( , 16).
图1 . GMSCs的体外形态和生长特性。
( A )A组供者年龄分布（13～31岁；平均年龄±SD，23.29±6.26岁； n =14），B组（37～55岁，平均年龄±SD，45.69±6.49岁； n =13），C组（59～80岁；平均年龄±SD，65.36±6.57岁； n =14）。 ( B )各年龄组的GMSCs在第8代和第11代之间的平均增殖率几乎相似。 ( C 到 K )A、B、C组的GMSCs在第0、8、12代体外培养（放大倍数×10；比例尺100μm）显示梭形成纤维细胞形态
流式细胞术分析第2代和第10代间的GMSCs表达MSC表面标志物。 我们的结果显示，所有传代的GMSCs均表达CD44、CD90、CD73、CD105等MSC表面标志物，未发现造血细胞的任何污染（CD34和CD45的表达可忽略），表明各年龄组供者的GMSCs均能在体外建立均匀培养( 图2A). 此外，GMSCs表现出这些表面标记的高表达，用平均荧光强度（MFI）进行量化( 图2B). 我们的研究结果与先前有关BM和DP来源的MSCs的研究一致，这些研究表明，细胞表面标记物的表达并不表明细胞的分化状态或其效力，也不能区分来自年轻和老年供体的MSCs( 4, 9, 34).
图2 . 干细胞和衰老标志物。
( A 和 B )A、B、C组GMSCs表达MSC表面标记物（CD44、CD90、CD73和CD105），而造血干细胞标记物（CD45和CD34）的表达微不足道。 ( C 到 E )SA-β-gal的代表性图像 +ve 第8代和第12代之间的细胞（SA-β-gal染色细胞的蓝绿色，图中突出显示；放大倍数×10；比例尺，100μm）。 ( F 和 G )C组GMSCs在第4～6代平均数和第9～12代平均数均显著高于对照组(* P ( H )C组GMSCs p53和SIRT1表达增强。 B组和C组的GMSCs基因表达谱与A组进行标准化。
来自年轻供体的GMSCs在体外增殖迅速，衰老速度加快 衰老细胞中溶酶体含量的增加表现为特异性溶酶体SA-β-gal的活性，这是鉴定衰老细胞最常用的生物标志物。 在我们的实验中，我们通过染色SA-β-gal来检测早期传代（表明体内细胞相对于供体年龄的衰老）和晚期（表明体外复制性衰老）GMSC培养中存在衰老细胞群。 图2（C到E）表示SA-β-gal的数量 +ve 第8代和第12代GMSCs的体外培养。 C组GMSC培养液中SA-β-gal明显增多 +ve 两种细胞均在早期（传代4-6；SA-β-gal的平均数量 +ve 单元格=136.25±44.9）( 图2F)晚期传代（第9～12代；SA-β-gal平均数 +ve 单元格=279.5±27.7）( 图2G). 与B、C组相比，A组GMSCs体外复制性衰老速度快，SA-β-gal增加13.5倍 +ve 与早期传代相比，传代后期的细胞数量增加了0.75倍，而C组则分别增加了1.05倍和0.75倍( 图2，F和G). 这些发现支持我们先前关于细胞在生命周期中经历的种群倍增数的观察。 每个细胞都有一个Hayflick极限，它定义了在经历衰老相关的凋亡之前，细胞在整个生命周期中可能经历的倍增次数( 37, 38). 由于来源于成人和老年人群的GMSCs已经在体内经历了大量的倍增，其体外群体倍增率和体外衰老率下降。 另一方面，较年轻的GMSC培养物在体外迅速繁殖，使其数量增加一倍，从而迅速向体外复制衰老方向发展( 图2，F和G).
在SA-β-gal表达方面的衰老暗示着细胞群体的老化，细胞的最终命运是凋亡或自噬。 为了支持我们的推测，随着供者年龄的增加，GMSCs消除了发生肿瘤的可能性，并维持了一个健康的干细胞库( 37, 38)与A组相比，C组GMSCs中p53（15倍）和sirtuin1（SIRT1）的表达增强（16倍）( 图2H). 这些发现表明，为了消除衰老对组织的不利影响并消除致瘤事件的可能性，固有细胞群经历了凋亡（通过上调p53表达）或自噬（SIRT1水平升高）来排除衰老细胞。
根据上述结果，我们进一步观察到C组GMSCs中CDKN2A（p16）的高水平( 图3A)这表明在可变压力条件下，DNA损伤反应是有效的，可以防止衰老相关的肿瘤发生。 CDKN1A（p21）在a组和C组的GMSCs中没有表现出明显的变化。因此，我们得出结论：C组GMSCs中高水平的p53通过抑制衰老组织中的病理/增生异常增殖或异常分化来维持基因组的完整性。 我们还观察到，由于细胞凋亡或自噬而导致的这种年龄相关性细胞群减少可由生长因子受体（如血小板衍生生长因子受体）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）和表皮生长因子受体（EGFR）等生长因子受体表达的增加所补偿( 图3B). 这一结果表明，GMSCs能增强其增殖能力，以对抗随着年龄增长而增加的应激条件，从而维持组织内稳态。 所有这些发现都表明GMSCs有能力对抗随着年龄增长而在牙周组织中累积的压力条件，从而最终促进增殖性扩张的维持，从而维持牙龈组织中健康的干细胞池。
随着健康干细胞数量的维持，迁移到损伤部位以促进伤口愈合，对于维持组织内稳态也是必要的。 然而，在体内外环境条件下，细胞迁移可能发生变化，从而影响组织修复过程。 在我们的体外培养中，我们观察到B组的GMSCs比A组和C组显示出最高的细胞迁移率( 图3，C至L，以及电影S1）。 由于差异不是很大，这进一步加强了我们的结论，即与其他几种来源的MSCs（包括BM、AT、PDL和DP）相比，GMSCs的生长和表型特征基本上不受供体年龄的影响( 4, 10, 11, 13, 16, 20, 21, 28– 36).
函数表征多系微分 GMSCs的多系分化倾向于神经发生 为了确定供体年龄对GMSCs多分化潜能的影响，我们诱导了GMSCs向脂肪、成骨和神经分化。 与B、C组相比，A组GMSCs有早期成脂分化迹象，并积累了大量的油球，A组GMSCs分化为脂肪细胞的比例明显高于C组( 图4，A至D).
在分化14～16天时，通过出现矿化的骨结节来观察GMSCs的成骨情况( 图4，E至G). 虽然碱性磷酸酶（ALP）水平没有差异( 图4H)茜素红S（ARS）染色的磷酸钙矿化( 图4，I到K)B组和C组成骨培养明显减少( 图4L). 由于ALP是早期成骨标记物，这些观察结果表明来自年轻和老年供者的GMSCs对初始成骨刺激的反应相似（如ALP水平相似所示），但这种趋势没有达到统计学意义， 可能是由于分化试验中普遍观察到的高度个体间差异( 23, 39). 碱性磷酸酶负责释放磷酸盐，并使其可被骨基质蛋白的功能群结合。 因此，上述观察结果表明，所有年龄组的GMSCs在体外成骨方面具有相似的潜力，但随着年龄的增长，其合成基质蛋白和在分化后期将磷酸盐纳入基质的能力下降。
出乎意料的是，我们没有观察到供者年龄的GMSCs的神经源性分化能力下降，而β-III微管蛋白和nestin的表达证实了这一点( 图4，M至R). 用×40倍放大的免疫染色图像测定两种神经标志物的MFI，两者无显著性差异( 图4S以及图S1）。 这种意想不到的神经谱系倾向可能是由于牙龈组织通过外-间充质分化过程起源于神经嵴。 此外，牙龈被检测出含有两个亚群的MSCs，包括90%的神经嵴源性GMSCs和10%的中胚层来源的GMSCs，其中神经嵴衍生的GMSCs具有较高的神经元分化潜能( 40, 41). 根据我们的研究结果和以前的报道，我们认为GMSC向神经元细胞系倾斜成熟，即使随着年龄的增长，GMSCs向神经细胞系的分化和成熟的趋势随着年龄的增长而下降。
为了推断我们关于GMSCs体外分化的发现，并确定GMSCs对骨组织再生的适用性，我们进行了异位骨形成。 将GMSC种子羟基磷灰石-胶原支架植入SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠体内，发现基质蛋白骨钙素的存在( 图5，A至D)和I型胶原( 图5，F至I)伴随着钙磷矿化的同化作用( 图5，K到N). 植入B组GMSCs的支架比无细胞支架（仅植入支架）和A、C组GMSCs的支架具有更高的骨钙素积累( 图5E). B组和C组GMSCs中另一种基质蛋白Ⅰ型胶原含量较A组下降30～40%( 图5J)提示虽然老化的GMSCs对成骨刺激有反应并分化为成骨细胞，但其对矿化基质的吸收能力随着年龄的增长而下降。 这些发现得到了钙和磷修复植入物的能量色散光谱（EDS）分析的支持。 随着GMSCs在体内成骨过程中的年龄增长，基质蛋白的同化能力下降，其结合磷酸钙进行矿化的潜力也显著降低( 图5O).
免疫调节行为在ALI中的应用 GMSCs抑制PBMNCs体外增殖，与供者年龄无关 为探讨GMSCs的免疫调节作用，采用植物血凝素（PHA）刺激的外周血单个核细胞（PBMNCs）与GMSCs共培养实验，观察其增殖和存活情况。 A、B、C组的GMSCs在体外对刺激的PBMNCs增殖的抑制率为1:7.5。 A组的GMSCs显示出较高的免疫抑制潜能，96小时时PBMNC的增殖比受刺激的PBMNC减少75.86%，而B组和C组在96小时时分别减少了60.74%和64.45%( 图6A). 这些发现表明，虽然老化的GMSCs的免疫抑制能力略有下降，但其免疫调节行为并不显著。
GMSCs可减轻炎症反应，促进受损肺组织的再生 炎症性肺疾病的发病主要与中性粒细胞浸润、促炎性细胞因子上调和其他一些退行性改变有关。 静脉注射骨髓间充质干细胞，然后迁移到肺毛细血管，最终导致其滞留在肺间隙，据报道，MSCs可免疫调节炎症环境条件( 42). 在我们的实验中，我们使用脂多糖来产生肺部炎症，并给予A、B和C组的GMSCs来研究它们的体内免疫抑制行为。 流式细胞术分析显示，与假对照组相比，LPS诱导ALI动物组的粒细胞（中性粒细胞）浸润明显增多。 A组和C组GMSCs可显著降低LPS诱导的ALI中的中性粒细胞计数，显示出较高的免疫抑制潜力( 图6B).
此外，A、B和C组的GMSCs也显示促炎细胞因子的基因表达下调，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素-γ（IFN-γ）； 图6，C至E). 由于这些细胞因子水平的下降并不显著，我们建议在信号通路水平上的机制分析可以更好地了解不同年龄组GMSCs的行为变化。 然而，这些细胞行为的变化也可以归因于我们的实验中使用瑞士白化小鼠，这提供了一个与人类相关的遗传变异性动物模型。 此外，纳入细胞因子谱将提供一个更好的洞察机制参与调节促炎性细胞因子。
肺切片的组织病理学分析显示，与假对照组相比，LPS诱发的ALI小鼠出现了广泛的损伤（包括中性粒细胞在肺泡和间质间隙的浸润、血栓形成、透明膜、蛋白碎片和变形的肺泡间隔）( 图6，F和G). 在LPS处理的小鼠中注射GMSCs可导致肺泡和间质浸润的中性粒细胞减少； 减少透明膜、蛋白碎片和血栓形成的发生； 也促进了肺泡间隔的结构改善( 图6，H至J). 组织病理切片的详细分析见 表1. 以上结果表明，来自所有年龄组供者的GMSCs改善了不同（不同）的肺损伤参数，表明如果将这些GMSCs用于人类患者的干细胞治疗，将能够改善整体肺健康状况。 虽然我们的实验涉及单剂量GMSCs的给药，随访期为4天，但我们推测，多轮给药后再进行较长时间的观察，可以更好地了解GMSCs的年龄相关免疫调节和再生行为。
ALI参数 假对照 脂多糖诱导ALI 脂多糖诱导ALI+ A组GMSCs 脂多糖诱导ALI+ B组GMSCs 脂多糖诱导ALI+ C组GMSCs （一） 中性粒细胞 牙槽间隙 - +++++ +++ +++ +++ （二） 中性粒细胞 间隙 - +++++ +++ ++ ++ （三） 透明膜 - +++ + + + （四） 蛋白质碎屑 - ++ + + + （五） 加厚 肺泡隔 - 3× 2× 2.5倍 2× （六） 脱皮 肺泡上皮 细胞 - ++ + ++ ++ （七） 血栓形成 - +++ + ++ +
表1 . GMSC治疗可减轻肺损伤的严重程度。
LPS诱导小鼠ALI的组织学分析显示LPS和GMSCs对肺损伤的不同参数。 观察A、B、C三组GMSCs对ALI各参数的影响。 “+”表示在组织学切片的至少10个随机位置存在给定参数。 对每组不同实验动物的8个切片进行分析，以评分肺损伤的严重程度。 所有组织学参数均与假手术对照组比较。
除上述实验外，我们还对成年年龄组小鼠（15～18周和27～30周）进行了类似的研究，得出细胞行为在很大程度上取决于受体的生态位条件。 在年轻小鼠中，A、B和C组的GMSCs可改善受损肺组织的整体健康状况。 而在成年和老年组小鼠中，我们注意到，尽管B组和C组的GMSCs参与了ALI损伤的再生，但它们在体内没有表现出免疫抑制行为。 成年和老年小鼠的肺损伤程度各不相同，但观察到B组和C组的GMSCs在一定程度上减轻了所有相关参数（图S2和表S1）。
讨论 2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行使全世界认识到生物风险的巨大后果，并恢复了对卫生保健研究和安全管理的关注。 此外，它还重申了我们对最脆弱的老年人群体的关注，因为任何国家的经济大部分都致力于医疗保健行业和老年人护理。 这是因为与年龄相关的共病对为老年人设计的治疗策略构成了几个障碍。 此外，与衰老相关的免疫衰老增加了老年人对各种感染的敏感性。 因此，为老年人量身定制细胞疗法已成为发展个性化医学和再生疗法的必然( 42).
老年性退行性疾病需要再生治疗方法来改善和舒适老年人的生活方式。 再生医学的主要作用是替换和恢复因损伤、创伤或衰老而受损的细胞、组织和器官的正常功能。 在过去的二十年里，干细胞研究领域的重大进展彻底改变了我们的再生医学方法。 与其他候选细胞相比，MSCs具有优越的遗传稳定性和移植后发生肿瘤（由于自发转化）的风险较低( 1, 11, 22). 对干细胞来源，包括BM，AT，DP，肌肉，脐带血和子宫内膜的广泛研究已经确立了以细胞为基础的组织工程方法作为治疗退行性疾病最有前途的方法。 然而，随着年龄的增长，干细胞产量和功能的下降阻碍了它们对自体细胞治疗的适用性。 虽然牙科组织本身是一种可供选择的选择，但缺乏对牙科干细胞的年龄相关研究限制了其临床应用价值。
我们的研究重点是研究这种牙龈组织的生物学特性，并强调其干细胞特性与供者年龄的关系。 牙龈结缔组织除了外-间充质来源外，还表现出一种独特的发育模式，一部分来源于滤泡周围的间充质（牙囊的外层），部分来自牙囊本身（牙囊的内层）( 23, 40, 41). 这一现象赋予牙龈组织独特的细胞群体（两个亚群：神经嵴衍生的GMSCs和中胚层衍生的GMSCs）的独特性，这些细胞群表现出独特的干细胞特性和对生长因子和压力条件的不同反应 ( , 40, 41, 43). 以前的一些研究表明老龄化对GMSC增殖和迁移的有害影响并未考虑到人口的这种多样性( 44, 45). 此外，关于年龄对GMSCs表型、生长、功能和免疫调节行为的影响还未见报道。 我们的报告是第一份研究供者年龄相关的GMSCs在再生医学中的应用的报告。
我们的发现提供了三个重要的见解。 第一个问题是从所有年龄的捐赠者中分离出大量的GMSCs，包括80岁以下的成年人。 与胚胎发育（干细胞快速分裂）不同，成年与细胞分裂减慢或静止有关，仅仅是为了维持组织内稳态( 30, 46). 就牙齿组织而言，DP似乎具有最高的更替率，如14至15岁的牙齿萌出和再萌出所示。 与DP相比，牙周组织如PDL和牙龈保持静止，并保持与骨骼干细胞相似的未分化但稳定的状态( 47, 48)从数量和/或质量上来说，建议保存干细胞池。 与此相关，我们观察到细胞形态、集落形成效率、增殖率、体外倍增数和MSC表面标记的表达与供体年龄无关（主要在早期传代期间，因为晚期传代涉及体外复制性衰老）。 与DP相关的类似报告显示MSCs无论供体年龄如何，都显示出最佳的生长和表型特征。 然而，这些细胞在体内外微环境下的表现是矛盾的( 16).
许多先前的研究已经强调，牙龈组织经常处于压力之下，这是由于经常接触细菌而导致牙龈炎症( 26, 27). 因此，GMSCs表现出更高水平的生长因子受体，有助于增强细胞增殖和维持组织内稳态( 46, 49). 在我们的实验中，PDGFR、FGFR和EGFR的表达增强支持了上述关于在频繁的微生物损伤和随着年龄增长的炎症环境下维持牙龈健康的报道( 49– 52). 然而，我们观察到来自老年供体的GMSCs更高的衰老群体和PDT的增加，这意味着由于广泛的体外传代，虽然老年GMSCs的体外衰老速度比年轻的GMSCs慢，但这意味着干细胞的干细胞损伤。 上述发现与先前的报告一致，即在给定的文化中存在几个亚群体( 9). GMSCs的体外群体由年轻和衰老的群体组成，SA-β-gal的数量可变 +ve C组细胞衰老的细胞命运可能引导GMSCs凋亡或自噬。 激活这两种机制支持维持健康的干细胞池。 因此，在我们的实验中，p53、SIRT1和CDKN2A的高表达提示了一种有效的DNA损伤反应，并降低了衰老相关致瘤性的可能性( 14, 30, 53– 55). 此外，p53和SIRT1的升高分别通过细胞凋亡或自噬来避免致瘤事件，从而有助于维持牙龈组织的内环境平衡，而由此导致的细胞数量下降通过生长因子受体表达的增强得到补偿。
第二个观点涉及GMSCs向神经元谱系的倾斜分化，与年龄无关，这表明使用GMSCs的干细胞疗法在需要神经元再生的治疗策略中表现更好。 此外，甚至未分化的GMSCs也表达神经干细胞标记物。 这种倾向于外胚层谱系可能与牙龈的进化历史和生理学有关( 56)这突出表明牙龈是神经嵴衍生干细胞的重要储存库，这些干细胞具有向中胚层和外胚层分化的能力( 23). 然而，体外对间充质细胞系（成骨细胞和成脂肪细胞）的作用随着年龄的增长而下降。 这种对分化因子反应性的差异证实了先前的说法，即牙龈组织包含了异质性细胞群( 40)微环境条件在控制细胞行为中起着重要作用( 49). 与此相关，一些早期的报告指出，造血干细胞（HSC）的功能随着年龄的增长而恶化，而HSC的数量没有任何下降( 2)然而，一些代谢活性非常高的细胞（如皮质神经元和心肌细胞）在一生中从未被替代( 2). 显然，我们的研究结果还表明，干细胞增殖和分化的微环境线索是完全不同的，并且相互独立。
我们的异位成骨实验证实了上述说法，该实验验证了在体外和体内条件下细胞行为的变化，也支持了微环境线索的作用( 16). 尽管在异位部位皮下植入GMSC种子可以确保不受骨固有细胞的干扰，也可以确定单纯由于GMSCs分化为成熟成骨细胞而导致的成骨，但它不能准确复制骨的微环境。 此外，由于缺乏与原始生态位相似的条件，一些基质蛋白表现异常，无法提供确凿的数据，但这并不意味着GMSCs的再生能力随着供体年龄的增加而下降。
有关MSCs再生潜能的研究表明，MSCs通过改善微环境，抑制过度激活的免疫系统，促进内源性修复。 MSCs也被发现对SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）感染不敏感，这支持了MSCs作为COVID-19潜在治疗选择的日益增长的需求( 57, 58). 我们的第三个观点是建议GMSCs作为治疗此类炎症的一个潜在的选择，为此我们研究了年龄如何控制LPS诱导的ALI模型中GMSCs的免疫调节行为。 我们观察到，肺泡和间质间隙中性粒细胞浸润增多，伴有肺泡间隔增厚、血栓形成、蛋白碎片积聚和肺泡上皮脱落等参数，都与肺部感染的严重程度有关( 59, 60). 静脉注射A、B、C组GMSCs可减轻上述大多数参数，显示有效的抗炎和再生反应。 我们的补充数据涉及在成年（15至18周龄）和老年（27至30周龄）小鼠中给药B组和C组GMSCs，结果表明，老化的GMSCs在受体小鼠体内产生再生性变化，但在抑制炎症性肺环境方面存在不足。 这些发现鼓励我们假设，完全康复可能需要给药多剂量的GMSCs，然后进行长期随访。 因此，我们的结论是，在研究年龄对基于细胞的再生治疗方法的影响时，应考虑细胞行为的年龄相关变化和局部微环境条件。
老年GMSCs在体外培养条件下以细胞自主的方式发挥作用，但其与移植后所处的生态位和微环境的相互作用是双向的。 因此，自然老化引起的生态位改变会影响移植细胞的存活和整合。 目前我们对模型的理解和阐述大多来源于体外细胞培养系统和体内动物模型，但并不能完全转化为人类的临床情况。 因此，设计干细胞疗法需要一种更全面的方法来调查和分析宿主微环境的可变性，因为来自生态位的有利线索决定了任何治疗的成功。 我们的数据强调了一项关于牙龈间充质干细胞来源研究较少的详细调查，并探讨了它们作为治疗急性炎症性肺疾病（如COVID-19）的效用。
材料和方法 牙龈组织的采集 在无预后的牙龈切除或拔牙过程中，从健康人身上获取牙龈组织。 在获得健康献血者书面知情同意后采集样本，分为3个年龄组：A组（13～31岁；平均年龄±SD，23.29±6.26岁）； n =14），B组（37～55岁，平均年龄±SD，45.69±6.49岁； n =13），C组（59～80岁；平均年龄±SD，65.36±6.57岁； n =14）( 图1A). 在无菌条件下采集牙龈样本，在冰上运输至实验室，在维护介质中，并在2小时内处理。
伦理声明 本研究的研究方案得到了印度普纳迪纳特曼格什卡尔医院和研究中心以及印度普纳萨维特里巴普勒普纳大学的机构伦理委员会的批准。 所有参与者均收到书面知情同意书。
GMSCs的分离与扩增 如前所述，将牙龈组织去上皮化并酶处理以获得单细胞悬浮液( 22). 细胞保存在α修饰的最低基本培养基（Sigma-Aldrich，英国）中，并添加10%胎牛血清（美国Gibco），在37°C和5%CO中培养 2 . 融合培养物用胰蛋白酶磷酸对葡萄糖[TPVG；0.1%胰蛋白酶，0.02%EDTA，0.05%葡萄糖在Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）；HiMedia，印度]进行传代培养，实验在第3代和第7代之间使用细胞进行（除非另有规定）。 每代传代后用台盼蓝排斥法测定细胞活力。
流式细胞仪表面标记分析 用流式细胞仪对GMSCs进行MSC表面标记表达的表型鉴定。 简而言之，第2代到第10代的细胞被胰蛋白酶化，在4°C下用3.7%的PFA固定15分钟，在4°C下用10%FBS封闭45分钟。然后用荧光铬标记的MSC CD标记物培养细胞等分，包括抗人CD44、CD90（BD Biosciences，USA）、CD73、CD105（eBioscience，USA）、CD34， CD45（HSC标记物；BD Biosciences，USA）抗体及其相应的同型对照品（均以1:100的稀释度）在4°C下保存45分钟。使用BD-FACSVerse获得标记细胞，并使用FACSuite软件（BD Biosciences，USA）进行分析。 计算表达MSC表面标记的细胞百分比和每个标记的MFI，并考虑用于分析（表面抗原的MFI与相应的同型对照标准化）。
SA-β-gal测定 衰老细胞中存在的β-Gal将X-半乳糖苷酶（X-Gal）裂解成5,5′-二溴-4,4′-二氯靛蓝，产生明显的绿蓝色。 简而言之，将第4-6代（早期传代）和第9-12代（晚期传代）之间的GMSCs以10的密度接种到一个6孔板中 4 每孔细胞数，并在37°C和5%CO中培养 2 . 4天后，用3.7%PFA在4℃下固定15分钟。用0.1%X-Gal和染色液（pH6）在37℃下染色24小时( 61). 通过蒸馏水洗涤和SA-β-gal的数量来停止反应 +ve 细胞在相差显微镜下计数（Magnus，Olympus，印度）。
实时PCR 在实时聚合酶链反应（real-timepolymerasechainreaction，PCR）中，用GoTaq-qPCR-mastermix（Promega，USA）和互补DNA（cDNA）以及10 pmol的基因特异性引物建立了10μl的反应。 使用的底漆顺序如表S2所示。 使用StepOnePlus系统（美国应用生物系统公司）设置实时PCR。 使用1个95°C循环2 min和40个95°C循环15 s和60°C 60 s进行扩增，然后进行熔融曲线分析。 用2 ??? 计算机断层扫描 方法。
细胞迁移试验 采用划痕法测定GMSCs在离体创面愈合中的迁移能力。 GMSCs以2×10的密度接种 4 在一个六孔板中每孔有一个细胞，细胞可以生长直到融合。 在单层培养中用微量移液管尖端造成伤口，并记录细胞迁移直到48小时。 每个时间点的图像都是用相衬显微镜拍摄的，并用Fiji ImageJ软件进行分析( 62). 伤口愈合百分比计算如下
GMSCs的体外分化 以前的研究者已经证明GMSCs可以进行成骨、软骨、脂肪和神经源的分化( 22– 24). 本实验旨在研究年龄对GMSCs多分化潜能的影响。 我们用成脂、神经和成骨诱导分别刺激各组的GMSCs。 对于每个实验，2×10 4 每孔细胞接种在24孔板中。
脂肪生成 融合后的GMSCs单层培养用脂肪诱导培养基诱导3天，然后在维持培养基中培养1天（产脂分化试剂盒，瑞士隆萨）。 诱导和维持7个周期后，用PBS冲洗细胞，用10%福尔马林固定1小时。 用油红O（3mg/ml；Sigma-Aldrich，UK）在37℃下对细胞积聚的油球进行染色1小时，之后呈红色。 在相差显微镜下观察染色细胞，并用显微镜定量观察积聚油滴的细胞数量。
成骨 GMSCs在StemPro成骨诱导培养基（Gibco，USA）存在下接受成骨刺激。 21天后，培养物用3.7%PFA在4℃下固定15分钟，并用40mm ARS（Sigma-Aldrich，英国）染色，以检测矿化基质的合成。 在相差显微镜下观察骨结节和ARS染色培养物，并采集图像。 用10%乙酸提取ARS染色液，在85℃下加热10min，然后离心，上清液用10%氢氧化铵中和。 在405nm处测定吸光度，以定量分析成骨培养物中的ARS。 标准图是用连续稀释的ARS在乙酸中绘制的。
ALP是成骨分化的早期标志物，因此，在成骨诱导的第5天进行ALP定量，以确定年龄对GMSCs成骨潜能的影响。 为了测定ALP浓度，收集成骨刺激的GMSCs，并在0.1%tritonx-100中制备细胞裂解物。 用含有1.5 mM MgCl的对硝基苯酚磷酸盐（3.75μg/μl；印度SRL）培养 2 和AMP（2-氨基2-甲基1-丙醇，pH 10.5；Sigma-Aldrich，UK）在37°C下30分钟。通过添加1 N NaOH停止反应，并在405 nm处测量吸光度。 使用NaOH中对硝基苯酚（Sigma-Aldrich，英国）的系列稀释液制备标准图。
神经发生 用于神经源性诱导的组织培养血管预涂5μg层粘连蛋白（Invitrogen，USA）和5μg聚乳酸- d -赖氨酸（MP Biomedicals，印度）。 GMSCs的融合单层培养物用添加FGF-2（10 ng/ml；Gibco，USA）、EGF（Gibco，USA）和1×N2增补剂（Gibco，USA）的DMEM-F12（Gibco，USA）孵育25天。 在分化周期的10～14d，神经元的分化与花环的形成有关。 25天后，用3.7%PFA在4℃下固定15min，用0.1%tritonx-100渗透，用10%FBS封闭1h。 随后用与Alexa Fluor 555（稀释1:200）或抗人β-III微管蛋白抗体（稀释1:300）（Invitrogen，美国）结合的抗人巢蛋白孵育2小时。 以山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）抗体（Invitrogen，USA；稀释1:100）作为β-III微管蛋白的次级抗体。 用鬼臼蛋白FITC（Sigma-Aldrich，UK）和罗丹明-鬼臼苷（Invitrogen，USA）染色细胞骨架。 染色后，将细胞安装在含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚的Ultra Cruz贴装培养基中（DAPI；美国圣克鲁斯生物技术公司），在40×和63×油浸物镜（德国莱卡SP5 II）下观察。 图像分析使用斐济ImageJ软件。 在×40倍的放大倍数下，用四个不同的位置测定β-Ⅲ微管蛋白和巢蛋白的平均强度。
异位骨形成 单元（10 6 )A、B、C组将GMSCs接种于羟基磷灰石-胶原支架上，用成骨诱导剂诱导。 在成骨刺激10d后，将有细胞或无细胞的支架植入BALB/SCID小鼠（6～8周，雄性）皮下。 无细胞支架作为阴性对照。 12周后从小鼠体内取出植入物，并分析骨基质蛋白的存在。
回收的植入物用抗人骨钙素和I型胶原抗体（Abcam，英国）染色，稀释度为1:200。 以美国圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology，USA）的驴抗兔FITC作为二级抗体，在含有DAPI（美国圣克鲁斯生物技术公司）的Ultra Cruz安装介质中进行植入。 在10×和60×油靶（Nikon a1r，日本）下观察了样品的10个不同区域，并使用Fiji ImageJ软件计算了mfi。
回收的植入物也进行了扫描电子显微镜（FEI Nova NanoSEM 450）处理，以通过EDS（Bruker XFlash 6I30）测定元素组成百分比。 植入物固定在3.7%PFA中，温度为4°C，固定15分钟，并使用连续稀释的乙醇脱水。 用溅射镀金的方法，在支架上的10个不同位置用EDS记录了钙和磷的元素组成。
GMSCs与PBMNCs共培养 GMSCs在各种慢性和急性炎症条件下具有免疫调节特性( 23, 25, 27, 63). 为了确定年龄对GMSCs免疫调节行为的影响，我们按照标准方案研究了A、B和C组的GMSCs与PHA（Sigma-Aldrich，UK）刺激的PBMNCs的相互作用( 64, 65). 用Ficoll（Histopaque；Sigma-Aldrich，UK）密度梯度离心法从人血中分离出PBMNCs。 血液采集和处理方案是由萨维特里白普勒浦那大学的机构伦理委员会批准的。 所有捐赠者都收到了书面知情同意书。 将GMSCs接种在96孔板中，使其粘附24小时。 用PHA（5μg/ml）刺激PBMNCs，并与γ辐照（30gy，16.58min；Gamma室GC-5000）GMSCs共培养。 γ射线能抑制GMSCs的增殖，但不影响其功能。 实验采用GMSC:PBMNC:1:7.5、1:12.5、1:15、1:25和1:50进行。 共培养72h和96h后，用MTT法检测细胞增殖情况。
GMSC对LPS诱导ALI模型的治疗作用 此外，我们利用LPS诱导的小鼠ALI模型，研究了供体年龄对GMSCs免疫调节特性的影响( 42). 许多先前的报告已经研究了人骨髓间充质干细胞在炎症性疾病小鼠模型中的抗炎特性，包括结肠炎、动脉粥样硬化和急性呼吸窘迫综合征( 25– 27, 42). 我们的实验模型是在瑞士白化小鼠（6至8周，雄性）鼻内注射浓度为5μg/g体重的LPS。 假对照组滴鼻给予PBS。 注射LPS 72小时后，A、B、C组的GMSCs（10 6 每只小鼠的细胞数）。 假手术组注射PBS。 实验分三次进行，每组取3个个体样本（每个样本4只，每个年龄组共12只）。 实验在GMSC给药96小时后终止，通过牺牲实验动物并分析其肺组织。 上述实验的方案涉及人文关怀，并得到浦那临床前研究与发展组织（PRADO）私人有限公司机构动物伦理委员会的批准。
肺组织和支气管肺泡灌洗（BAL）中浸润中性粒细胞数量的增加和促炎性细胞因子浓度的增加提供了炎症反应的相关测量( 59, 60). 因此，我们收集了BAL并采集了肺部进行进一步分析。 BAL以2000转/分离心15分钟分离细胞和肺上清液。 用流式细胞仪分析细胞成分，以确定浸润的中性粒细胞百分比。 除BAL外，还用流式细胞术研究了全肺单细胞悬液在肺组织中是否存在中性粒细胞。 在散射图分析的基础上，对中性粒细胞（粒细胞）进行门控( 66).
对BAL细胞组分进行实时PCR检测，检测促炎细胞因子基因表达的调控。 用美国Applied Biosystems公司的PowerUp-SYBR-Green-Master-Mix（Applied Biosystems，USA）和10μmol基因特异性引物建立了10微升的反应体系。 使用的底漆顺序如表S2所示。 采用StepOnePlus系统（美国应用生物系统公司）建立实时PCR。 使用1个95°C循环10分钟和40个95°C循环15 s和60°C 60 s进行扩增，然后进行熔融曲线分析。
组织病理学分析：小鼠肺固定于4%福尔马林中，石蜡包埋，切片，苏木精和伊红染色以评分炎症。 组织学分析采用双盲法进行，切片在明亮视野显微镜（Magnus，Olympus，India）下观察，以评分以下参数：（i）中性粒细胞在肺泡的浸润；（ii）间质间隙； （iii）纤维蛋白聚合形成的透明膜渗漏到间质/肺泡间隙； （iv）肺泡腔中存在蛋白质碎片（如纤维蛋白链）； （v） 肺泡间隔增厚； （六）肺泡上皮脱落； （七）血栓形成( 59, 60).
统计 在每一个实验中，我们从每一个年龄组的第3代到第7代之间的5个随机样本中使用GMSCs。 每个实验分三次进行，并使用SigmaPlot 13进行统计分析。 单因素方差分析（ANOVA）采用所有两两多重比较程序或对照组（Holm-Sidak法）评估统计显著性(* P P P 数据用平均值表示，误差条表示SE/SD（如规定）。
