简介 在现代社会，暴露在不规则的光照时间安排下，例如轮班工人所经历的那些，已经变得越来越普遍( 1). 当这些不规则的光照条件持续一段时间后，会对人体健康产生有害影响，包括昼夜节律和睡眠障碍、认知缺陷和情绪障碍( 2, 三). 在哺乳动物中，环境光在视网膜中被处理，并通过被称为视网膜神经节细胞（rgc）的投射神经元传递到大脑目标。 在RGC亚型中，固有的光敏性黑色素沉着素( Opn4型 )–表达RGC（ipRGCs）传递影响先天功能的光信号，如内源性昼夜节律与明暗周期的同步( 4– 6). 使用动物模型的研究，以及从人类受试者收集的数据，进一步暗示了ipRGC信号在调节代谢功能、认知和情感行为中的作用( 7– 10). 我们最近描述了一个ipRGC脑回路，它驱动不规则光对小鼠情绪相关行为的有害影响( 11). 该电路将环境光信息导向丘脑背侧的缰周核（PHb），投射到边缘区域，包括腹内侧前额叶皮质（vmPFC）、背内侧纹状体（CPu）和伏隔核（NAc）。 操纵PHb对这些边缘靶点的投射揭示了PHb对于调节光对小鼠情绪的影响是必要的和充分的( 11, 12). 虽然PHb神经元在传递光信息到边缘区的作用已经被研究过，但是丘脑回路和编码和处理光信息的细胞机制仍然是未知的。
哺乳动物丘脑在将感觉信息传递到不同的皮层区域中起着至关重要的作用( 13, 14). 丘脑核主要由兴奋性（谷氨酸能）中继神经元组成( 15). 与大多数小鼠背侧丘脑不同，视网膜受体背侧膝状体核（dLGN）包含一组抑制性（gaba能）中间神经元，在空间和时间上同步局部网络( 15– 17). 此外，丘脑核团接收来自丘脑网状核（TRN）和丘脑外系统的抑制性输入，该系统由前脑和中脑核组成，被认为可以调节和分级输出信号，使丘脑皮质功能正常( 18). RGCs的丘脑靶点包括dLGN，负责图像形成的视觉功能，以及控制先天和情绪相关行为的细胞核，包括PHb和丘脑后核( 11, 19, 20). 尽管这些丘脑区域有大量的视网膜神经支配，但在我们对图像形成视觉网络之外的光是如何被处理的理解上还是有一个关键的空白。 在这方面，ipRGC-PHb电路代表了一个独特的系统，用来探索丘脑对光信息的处理，从而影响先天和情绪相关的行为。
在这里，我们研究了PHb电路处理光信号在规则和不规则的明暗时间表。 我们发现丘脑背侧的gaba能神经元聚集在视觉中心，并在PHb内形成视网膜受体回路。 PHb公司 氨基丁酸 神经元具有局部和长程投射，构成丘脑和丘脑下GABA能神经元的更大回路，表明PHb是一个网络的一部分，其延伸超出了先前描述的边缘靶点( 11). 这些长程抑制连接将PHb与dLGN区分开来，后者只包含局部抑制网络( 21). PHb公司 氨基丁酸 神经元对长期暴露于不规则的明暗周期特别敏感，导致在该核内观察到的基因表达的日常变化发生变化。 破坏PHb的日常活动模式 氨基丁酸 神经元足以导致情绪相关行为的缺陷。 总之，这些结果揭示了PHb视网膜受体抑制网络的日常变化对于处理控制小鼠情绪相关行为的丘脑回路的光输入至关重要。
结果 PHb包含视网膜受体gaba能神经元 研究了成年野生型（WT）小鼠丘脑PHb回路的细胞结构。 兴奋性中继神经元通过 Slc17a6型 ( Vglut2 )在皮层下结构的兴奋性神经元中发现的表达，包括丘脑( 22). 原位杂交显示兴奋性接力神经元均匀分布于丘脑背侧，占PHb神经元的74%( 图1，A至C). 我们进一步发现PHb中有密集的GABA能神经元( 图1、B和C，和图S1A），如囊泡GABA转运体共表达所示( Vgat公司 )谷氨酸脱羧酶1和2( Gad1型 和 Gad2 分别为：； 图1D). PHb公司 氨基丁酸 神经元不表达先前描述的丘脑核内神经元标记物( 23– 25)包括parvalbumin和生长抑素（图S1B）。 PHb的电生理特性 氨基丁酸 神经元识别出三个功能亚群，定义为快尖峰细胞、准快尖峰细胞和随去极化电流脉冲容易进入去极化阻滞的细胞（图S1、C和D）。
图1 . 视网膜受体PHb的细胞排列。
( A )突出显示PHb的冠状脑切片示意图。 ( B 和 C )兴奋性继电器典型的原位标记( Vglut2 + )和抑制性( Vgat公司 + )PHb神经元显示（B）。 PHb百分比 Vglut2 + 和 Vgat公司 + 神经元（C）。 数据为平均数±扫描电镜( n =5只老鼠）。 ( D )代表性图片显示 Vgat公司 , Gad1型 ，和 Gad2 在PHb神经元中。 数据为平均数±扫描电镜( n =5只老鼠）。 ( E )代表性图片 GAD2 麦克里 丘脑背侧的细胞和视网膜纤维（CTB）分布。 ( F 和 G )罗斯特罗尾侧分布 GAD2 + PHb（F）的神经元和视网膜纤维。 通过前后坐标（距bregma的距离）来确定PHb的头端至尾侧断面。 数量 GAD2 + 神经元与视网膜对PHb（G）的输入有关。 视网膜输入以CTB覆盖的PHb总面积的百分比表示 + 视网膜纤维。 数据为平均数±扫描电镜( n =4只老鼠）。 斯皮尔曼相关 r =0.7902， P =0.0033。 ( H 和 我 )单突触狂犬病病毒策略（H）示意图。 82%的rgc为黑素免疫阳性（I）； 60%的逆转录标记细胞对应于M1-ipRGC亚型，40%对应于M4亚型。 ( J 到 我 )视网膜终末和PHb神经元之间功能联系的光遗传学证据。 典型PHb对光刺激的电流响应 氨基丁酸 神经元显示（K）。 PHb总量的一小部分 氨基丁酸 神经元( n =9个细胞）显示ChR2诱导的反应（L）。 LHb，外侧缰核； 背外侧核； LP，外侧后核； PO，后复合体； 中央外侧核； 背内侧核。 比例尺，100 mm（D）和200 mm（B、E和F）。 另见图。 S1和S2。
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为了正确地确定gaba能神经元在丘脑背侧的分布，我们使用了表达报告基因的小鼠系 麦克里 由内源性的 Gad2 发起人( GAD2 麦克里 老鼠）。 GAD2 + 神经元在PHb内形成一个明显的团簇，最密集地分布在其尾部区域( 图1，E至G). 此外，如前所述，在dLGN中观察到GABA能神经元（图S1D）( 26); GAD2 + 丘脑背侧邻近的核团内细胞或缺失或稀疏分布( 图1E以及图S1E）。 这些结果进一步通过WT小鼠体内gaba能标记物的原位杂交得到证实（图S1、F和G）。
视网膜受体PHb 氨基丁酸 神经元与兴奋性中继神经元局部连接 PHb由视网膜纤维密集支配，尤其是在其尾部( 11)其中gaba能神经元最为丰富。 在这里，我们绘制了视网膜神经分布图 GAD2 麦克里 小鼠玻璃体内注射霍乱毒素b亚单位（CTb）。 我们观察到PHb的视网膜神经分布模式与 GAD2 + 细胞( 图1，E至G)表明光信号直接调节神经元间的功能。 为了验证这种可能性，我们首先使用单突触狂犬病病毒追踪策略来确定rgc是否与PHb中的gaba能细胞直接联系。 GAD2 Cre公司 小鼠在PHb中注射a Cre公司 -依赖性腺相关病毒（AAV）/TVA-oG-绿色荧光蛋白（GFP），4周后，小鼠注射G-缺失狂犬病mCherry病毒( 图1H以及图S2A）。 我们观察到整个视网膜逆行标记的rgc（图S2B），其中大多数（82%）对黑素素免疫阳性，属于M1（60%）和M4（40%）ipRGC亚型( 图1I以及图S2C）。 视网膜输入到PHb 氨基丁酸 用光遗传学方法进一步评估神经元。 具体地说，在视网膜终末【玻璃体内注射AAV2/ChR2-增强的黄色荧光蛋白（EYFP）后，视网膜终末表达通道视紫红质2（ChR2）】，并从视网膜终末的PHb神经元获得全细胞电生理记录 GAD2 麦克里 老鼠( 图1J). 蓝光激发PHb中gaba能神经元亚群的兴奋性突触后电流激活ChR2表达的视网膜终末( 图1，K和L)以及兴奋性中继神经元（图S2D）。 总之，这些结果证实了iprgc除了兴奋性中继神经元外，还与PHb内的gaba能细胞有单突触联系，这在以前的观察中得到了扩展( 11, 12).
为了确定视网膜受体gaba能细胞是否调节局部PHb回路，我们通过注射a Cre公司 -依赖性AAV表达的荧光团标记细胞投射（td番茄）和突触终末（GFP）进入PHb GAD2 Cre公司 老鼠( 图2A). 首先，我们观察到PHb 氨基丁酸 神经元在PHb尾部有密集的局部联系，并投射到丘脑背侧的邻近区域( 图2、B和C). gaba能神经元主要位于PHb的尾侧，也显示向核的吻侧区扩散的投射( 图2D表明这些gaba能细胞可以调节局部和（吻侧）远端兴奋性中继PHb神经元的功能反应。 为了测试这个， GAD2 Cre公司 小鼠在PHb中注射a Cre公司 -表达ChR2-eYFP的依赖性AAV（图S2F）。 光生刺激ChR2表达gaba能PHb神经元，在分布于PHb吻尾侧的兴奋性中继神经元中诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）（图S2、G和H），与PHb的广泛投射一致 氨基丁酸 细胞。 PHb激活 氨基丁酸 神经元抑制兴奋性中继神经元的诱发尖峰，这种作用被GABA阻断 A 受体拮抗剂picrotoxin（图S2I）。 此外，通过河豚毒素（TTX）阻断动作电位传播，oIPSCs被取消，并在加入钾通道阻滞剂4-AP后恢复（图S2J），表明兴奋性中继神经元接收来自PHb的功能性单突触输入 氨基丁酸 神经元。 综合起来，这些结果表明PHb包含一个独特的视网膜受体gaba能神经元簇，这些神经元在PHb的兴奋性中继神经元上形成功能性单突触连接。
图2 . PHb的连通性 氨基丁酸 神经元。
( A ) Cre公司 -将表达tdT和突触前突触素融合eGFP的依赖性aav注入PHb GAD2 Cre公司 老鼠。 ( B 到 D )在PHb和邻近区域（B和C）发现gaba能投射。 PHb突触输入（绿色）和胞体（洋红色）的Rostro尾端分布 氨基丁酸 神经元数量在（D）中。 结果用SynGFP的密度表示 + 在PHb尾端观察到的相对于总点状的斑点。 此外，GABA的分布 tdT公司+ 显示PHb中的细胞。 根据大脑坐标确定头端（R）、中部（M）和尾部（C）PHb区域（见材料和方法）。 数据为平均数±扫描电镜( n =4只老鼠）*** P <0.001，与尾侧PHb比较，单因素方差分析。 n、 不重要。 ( E )稀疏PHb 氨基丁酸 （tdT） + )在vmPFC、CPu和NAc中观察到纤维。 PHb的典型图像及重建 氨基丁酸 显示了投影。 ( F 到 我 )致密PHb 氨基丁酸 在对侧PHb、同侧TRN和Zi中观察到投射（F；箭头表示同侧投射）。 PHb代表图片 氨基丁酸 纤维（tdT + )和突触接触（GFP + )靶细胞位于TRN（G）、Zi（H）和对侧PHb（I）。 ( J )PHb面积 氨基丁酸 神经支配相对总核面积被量化。 数据为平均数±扫描电镜( n =5只老鼠）。 ( K )包含PHb的抑制性丘脑网络示意图 氨基丁酸 神经元。 实线表示双向连接，虚线表示PHb的投影 氨基丁酸 细胞。 腹后复合体。 比例尺，50 mm（嵌入C）、100 mm（B和C）和200 mm（E至I）。 另见图。 S2和S3。
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PHb是丘脑和丘脑下一个更大的抑制网络的一部分 我们的追踪分析表明PHb 氨基丁酸 神经元除了它们的局部连接外，还可能将投射延伸到PHb区域之外。 最近有人提出PHb投射到NAc的离散路径包含GABA能纤维( 12). 通过对PHb投影模式的研究 氨基丁酸 神经元 GAD2 Cre公司 小鼠注射 Cre公司 -依赖性AAV表达tdT-2A-SynGFP( 图2A)，我们观察到PHb神经支配稀疏甚至完全缺失 氨基丁酸 NAc、vmPFC和CPu中的神经元( 图2E)，兴奋性中继PHb神经元的靶区( 11). PHb的投影 氨基丁酸 在NAc或vmPFC中注入逆行aav（retroAAVs）进一步探索进入NAc或vmPFC的神经元（图S3，A和E）。 我们发现，与兴奋性中继细胞相比，GABA能神经元只占NAc投射PHb神经元总数的一小部分（图S3，a到D）。 此外，我们发现，虽然vmPFC接受来自兴奋性中继PHb神经元的大量输入，但该区域的gaba能神经支配实际上是缺失的（图S3、E和F）。
对GABA能投射的综合分析显示PHb 氨基丁酸 神经元具有广泛分布的丘脑连接模式，超出了局部PHb回路( 图2F). PHb公司 氨基丁酸 神经元广泛分布于对侧PHb的尾侧、TRN的背侧和丘脑底的incerta带（Zi； 图2，F至J). 在这些区域观察到的突触素融合的GFP小点提示与靶神经元存在突触接触( 图2，G至I). 追溯工具追溯标签 GAD2 + 向PHb投射的细胞和单突触狂犬病病毒策略进一步揭示了PHb 氨基丁酸 神经元嵌入在一个抑制性网络中，该网络将丘脑背侧与TRN和Zi双向连接（图S3，G至L），这些区域已知向丘脑区域发送抑制性输入( 18). 这些结果表明PHb 氨基丁酸 神经元除了具有局部联系外，还是更大的丘脑和丘脑下抑制网络的一部分( 图2K)与其他丘脑核团相比，PHb是一个独特的方面。
不规则的光照会破坏控制PHb神经传递平衡的基因的日常表达 我们先前的研究表明，在不规则的明暗时间安排下，由兴奋性PHb神经元驱动的光信号改变了小鼠的情绪相关行为( 11). 我们目前的研究结果显示，PHb还含有视网膜受体GABA能神经元，这些神经元可局部调节兴奋性中继神经元。 因此，我们研究了异常光信号在多大程度上引起PHb电路的改变。 为此，我们使用RNA测序（RNA-seq）来全面检查PHb内发生的组织范围内的转录变化。 小鼠按照规则（T24周期）或不规则（T7周期，3.5小时明暗交替周期，持续2周）的明暗时间表进行饲养。 根据小鼠活动情况，在活跃期[昼夜节律时间（CT）14]或非活动期（CT2）收集PHb样本( 图3A以及图S4、A和B）。 所有的生物复制都显示丘脑标记基因的强烈富集( 图3B)证实了组织切片的准确性。 通过对T24周期小鼠活动期和非活动期转录变化的分析，发现了差异表达的基因，包括时钟基因 每2 ，GABA受体A亚单位 Gabrr2型 ，以及整体膜组件( 氯5 和 Gja5型 ; 图3C以及图S4C）。 差异调节基因的功能注释表明，CT14基因上调在昼夜节律和生物节律以及转录调控中起着关键作用，而在非活性期上调的基因则与细胞结构重组有关( 图3D). 为了深入了解昼夜周期中基因表达的正常时相变化，我们进行了基因集富集分析（GSEA）( 27). 我们发现，与gaba能突触传递相关的基因在小鼠活跃期（CT14）富集，而与细胞呼吸相关的基因在非活跃期（CT2；图S4D）丰富。
图3 . 不规则的光照会破坏PHb基因表达的日常振荡。
( A )小鼠被关在T24或T7周期下2周和1天的恒定黑暗（DD）。 在CT2或CT14处采集PHb样品。 取3只小鼠标本（双侧解剖）合并。 每个条件下分析四个重复。 ( B )标准化基因表达热图（方差稳定对数 2 -转化计数）在丘脑中富集的转录因子样本中( 罗拉 , Tcf7l2型 , Zic1公司 , Lef1型 , Nr4a2 , Mef2c公司 , Etv1型 ，和 Foxp2型 )缰复合体( Pou4f1 , 神经1 ，和 Irx2 )以及海马颗粒细胞特异性标记基因( Lct公司 和 Trhr公司 ). ( C )火山图显示小鼠活动期（CT14）和非活动期（CT2）在T24周期下的显著差异表达基因（FDR<0.05和| log） 2 FC |>1）。 红点和蓝点分别代表CT14显著上调和下调的基因。 ( D )DEGs的功能注释。 ( E )不规则T7周期小鼠差异表达基因的火山图。 黑点代表在T24循环下发现显著和差异表达的DEG。 请注意 晶圆厂7 星形胶质细胞表达的脂肪酸结合蛋白7基因是唯一一个在T7周期暴露后仍有显著变化的基因，提示胶质细胞可以逆转节律性。 ( F )原位（RNAscope）标记的代表性图像 Gabra5型 如图所示。 慢性T7周期暴露后，正常光周期下基因表达的每日变化被消除。 数据为均值±扫描电镜*** P <0.001，双尾学生 t 测试。 比例尺，50μm（F）。 A、 U.，任意单位。 另见图。 S4和S5。
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接下来，我们检查PHb神经元的每日转录变化是否受到不规则光照时间（T7周期； 图3A). 值得注意的是，我们发现小鼠暴露在不规则的光-暗时间安排下，破坏了在正常光照条件下观察到的基因表达的阶段性( 图3E). 在正常光照条件下表现出强烈的相位变化的基因在不规则光照后发生了实质性的改变( 图3E). GSEA比较了从T7周期和T24周期下的小鼠CT14采集的样本，结果表明，在不规则光照后，参与膜去极化和谷氨酸分泌调节的基因被富集（图S4D）。 总的来说，这些结果表明，不规则光照引起的光反应回路的慢性和异常激活导致PHb神经元基因表达和神经传递的日常振荡发生广泛变化。
为了进一步了解不规则光照对PHb神经传递的影响，我们检测了正常和不规则光照下与突触传递相关的基因的表达。 在T24周期中，大多数与GABA能信号相关的基因表现出阶段性变化，包括参与GABA代谢的基因（例如。， Gad1型 , Gad2 ，和 阿巴特 )，运输商（例如。， Slc6a1系列 和 Slc6a11型 )和受体（例如。， 格布尔克 , 加布拉1 ，和 Gabrg2–3号 ; 图S4E）。 在与谷氨酸信号相关的基因中也观察到在正常条件下基因表达水平的阶段性变化（图S4F）。 然而，暴露在不规则的明暗周期中，几乎所有GABA能和谷氨酸能基因的相表达减弱（图S4、E和F）。 用原位杂交标记验证了gaba能和谷氨酸能基因表达模式的改变。 首先，我们证实，在正常的光照条件下，GABAergic的表达水平( Gabra5型 和 Gabra2型 )和谷氨酸( 格林2A 和 凸轮2A )PHb基因在小鼠活动的不同阶段（T24周期； 图3F以及图S5）。 我们进一步证实，在不规则光照（T7周期； 图3F以及图S5）。 总之，我们的转录分析显示，异常的光照破坏了PHb中控制这些回路中神经传递稳态的遗传程序的每日振荡。
暴露于不规则的光照会破坏PHb内的局部抑制控制 不规则光照导致PHb组织水平上的日常基因表达发生广泛变化。 为了探讨光介导PHb变化的分子机制，我们测定了PHb神经元的光反应性 GAD2 麦克里 小鼠在T24或T7周期下饲养2周( 图4A). 在正常光照条件下，gaba能神经元和兴奋性中继神经元都表现出强烈的光介导的即刻早期基因诱导 Fos系列 （也称为c-Fos）( 图4，B至E，以及图S6A）。 我们观察到c-Fos的数量显著增加 + T7周期与T24周期暴露小鼠gaba能神经元的比较( 图4，D和E)，表明PHb 氨基丁酸 神经元因不规则光刺激而敏化。
图4 . 不规则的光照会破坏PHb内的GABA能信号。
( A )小鼠被关在T24或T7周期下2周，在恒定黑暗（DD）下1天，最后暴露于CT14（小鼠活动期）的光脉冲。 ( B )光介导c-Fos诱导（绿色）的典型图像和重建 GAD2 麦克里 老鼠。 ( C )光诱导c-Fos总数 + 在T24或T7光周期下观察到的PHb细胞。 数据为平均数±扫描电镜( n =5只老鼠），双尾学生的 t 测试。 ( D )占总c-Fos的比例 + GABA能细胞( GAD2 麦克里+ )PHb神经元。 数据为平均数±扫描电镜( n =5只老鼠）* P <0.05，双尾学生 t 测试。 ( E )占总数的百分比 GAD2 麦克里 PHb细胞是c-Fos + . 数据为平均数±扫描电镜( n =5只老鼠）* P <0.05，双尾学生 t 测试。 ( F )自发活性PHb百分比 氨基丁酸 T24或T7光周期下的神经元。 沉默和自发活跃PHb的代表性痕迹 氨基丁酸 神经元如图（左）。 自发活动PHb的平均燃速 氨基丁酸 神经元（右）。 数据为平均数±扫描电镜( n =8到10）** P <0.01，双尾学生 t 测试。 ( G )T24和T7光周期下PHb兴奋性中继神经元的sIPSC频率和振幅。 从兴奋性中继PHb神经元的sIPSCs的代表性痕迹显示。 数据为平均数±扫描电镜( n =10到11只老鼠）* P <0.05，双尾学生 t 测试。 比例尺，100μm（B）。 另请参见图S6。
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接下来，我们研究了PHb是否增强了光响应性 氨基丁酸 神经元与其内在兴奋性的变化有关。 PHb的全细胞记录 氨基丁酸 离体脑切片中的神经元来自 GAD2 麦克里 小鼠暴露于T24或T7光周期。 我们发现PHb增加了 氨基丁酸 与T24周期相比，T7周期暴露于小鼠的神经元自发活跃，显示出基础放电率的增加( 图4F). 然后我们确定PHb的自发活动是否增加 氨基丁酸 神经元影响兴奋性中继神经元。 我们观察到，与对照组相比，T7周期引起兴奋性中继PHb神经元自发IPSCs（sIPSC）频率显著增加，sIPSC振幅没有变化( 图4G). 此外，在各组之间，未观察到微型IPSCs（mIPSCs）频率或振幅的差异（图S6、B和C）。 这些结果表明PHb的自发放电率增加 氨基丁酸 神经元驱动增加的抑制性突触传递到兴奋性中继神经元。 为了确定局部gaba能输出到兴奋性中继PHb神经元之间突触传递的有效性，我们记录了兴奋性中继PHb神经元的光生诱发IPSCs（oIPSCs） GAD2 Cre公司 表达ChR2-eYFP并置于T24或T7光周期下的小鼠（图S6D）。 我们发现PHb 氨基丁酸 与对照组小鼠相比，T7周期小鼠兴奋性接力神经元中的诱发OIPSC增强（图S6、E和F）。 在不同频率的列车期间，未观察到OIPSC的变异系数、成对脉冲比或抑制的差异，这与这些突触的突触前释放概率或短期可塑性没有变化一致（图S6，G至N）。 总之，这些结果显示长期暴露于不规则的光-暗循环中可增强PHb的光反应性和兴奋性 氨基丁酸 神经元，增强GABA能连接，增加动作电位依赖的GABA释放到兴奋性中继PHb神经元上。
选择性和慢性刺激PHb 氨基丁酸 神经元会导致情绪相关的缺陷 我们的结果显示PHb 氨基丁酸 神经元在不规则光照条件下的变化尤为明显，表明gaba能神经元在调节PHb电路局部功能中起着重要作用。 因此，我们假设只破坏PHb的每日振荡 氨基丁酸 神经元可能足以改变PHb电路的局部处理，最终改变其输出信号。 为了验证这一点，我们使用了一种化学遗传学策略，这种策略基于由设计药物（恐惧药）激活的设计受体( 28)评价慢性和不规则激活PHb对转录和行为的影响 氨基丁酸 神经元。 GAD2 Cre公司 小鼠双侧在PHb内注射a Cre公司 -依赖性AAV编码兴奋性（Gq）受体或对照AAV/td番茄( 图5A). 注射4周后，小鼠接受设计配体氯氮平- N -饮用水中氧化二氮（CNO）选择性激活神经元表达设计受体（hM3Dq； 图5，A和B，以及图S7A）。 在正常的T24周期中，小鼠在夜间活动和饮水量最高( 11, 29)从而导致PHb的慢性不规则激活 氨基丁酸 CNO摄入引起的神经元。 在CNO治疗期间，未观察到运动活性的显著变化（图S7，B至D）。 我们首先评估了这种范式对与gaba能和谷氨酸能信号相关基因表达水平的影响。 从饮用水中长期接触CNO的对照组和表达恐惧的小鼠中采集PHb样本，用定量聚合酶链反应（qPCR）定量基因表达。 我们发现参与GABA能信号传导的基因表达水平显著降低，包括那些参与GABA转运和代谢的基因( Vgat公司 , Gad1型 ，和 Gad2 )以及GABA能受体的显著增加( Gabra2型 和 Gabra4型 ; 图5C). 与谷氨酸信号相关的基因表达也发生了改变。 特别是，我们观察到调节谷氨酸代谢的基因表达显著降低( Gls2型 )兴奋性突触表达增加( C1ql3型 , 凸轮轴2B ，和 Slc17a7型 )和显著的离子性变化( 格里亚2 和 格里克1 )代谢代谢的( Grm5 )受体表达( 图5D). 总的来说，这些结果表明PHb的异常激活 氨基丁酸 神经元促进PHb转录谱的破坏。
图5 . 慢性手法治疗PHb 氨基丁酸 神经元。
( A ) Cre公司 -将表达依赖性恐惧和对照表达td番茄的AAVs分别注入PHb GAD2 Cre公司 老鼠。 4周后，动物按常规的T24周期饲养，并在饮用水中饮用CNO 2周。 ( B )在PHb中检测td番茄的表达 氨基丁酸 神经元； c-Fos诱导（绿色）证实CNO诱导的神经元激活。 显示了具有代表性的图像。 量化如图S7A所示。 ( C 和 D )相对mRNA表达（2 ? ΔΔct )PHb慢性恐惧激活的比较 氨基丁酸 对照组神经元为gaba能（C）和谷氨酸（D）信号分子。 生物复制( n =3）集合样本。 与对照组（假设值=1，虚线）进行统计分析* P <0.05** P <0.01，一个样本 t 测试。 ( E 到 G )PHb慢性激活 氨基丁酸 神经元导致情绪改变的行为表现，如强迫游泳（E）、尾部悬吊（F）和新奇抑制进食（G）测试所示。 数据为平均数±扫描电镜( n =8到9只老鼠）* P <0.05** P <0.01，双尾学生 t 测试。 比例尺，100μm（B）。 另请参见图S7。
接下来，我们评估慢性操纵PHb是否 氨基丁酸 神经元足以驱动行为缺陷。 使用相同的化学发生模式( 图5A)我们发现PHb的不规则激活 氨基丁酸 神经元导致情绪相关行为反应的缺陷。 特别是在PHb中表达恐惧受体的小鼠 氨基丁酸 在强迫游泳过程中，神经元的静止时间明显增加( 图5E)和尾部悬挂( 图5F)测试。 此外，我们观察到新奇抑制喂养试验的缺陷，这反映在接近和食用食物的潜伏期显著增加( 图5G以及图S7、E和F）。 总的来说，这些结果揭示了慢性改变PHb抑制网络的正常功能，即使是在有规律的明暗循环下的小鼠，也足以引起情绪障碍的行为表现。
讨论 PHb最近被鉴定为丘脑中枢，在光照环境变化时调节小鼠的情绪( 11). 先前的研究表明，由PHb神经元驱动的异常光信号投射到vmPFC、CPu和NAc会导致情绪相关行为的缺陷( 11, 12). 在这里，我们解剖了丘脑回路，这些回路局部编码和处理光信息来影响情绪。 具体地说，我们揭示了由ipRGCs检测和路由的光直接调节PHb的视网膜受体抑制电路的功能，该电路局部影响兴奋性中继神经元。 这种抑制性PHb网络也是丘脑和丘脑下GABA能网络的一部分。 PHb选择性化学操作破坏gaba能回路 氨基丁酸 神经元会导致情绪相关行为的严重缺陷。
丘脑背侧的gaba能神经元形成不同的团簇 gaba能神经元分布于多种哺乳动物的丘脑背核( 30, 31). 然而，有人假设，除了视觉dLGN，gaba能神经元在啮齿动物的丘脑中几乎不存在，特别是在小鼠和大鼠( 32). 最近的研究报告了小鼠丘脑中存在的个体发生和分子上不同的中间神经元的更广泛的复杂性( 25). 在这里，我们发现PHb 氨基丁酸 神经元，由共同表达 Vgat公司 , Gad1型 ，和 Gad2 ，不表达parvalbumin或生长抑素，TRN神经元的典型标志物( 23, 24)，或nNOS，先前被证明描绘了dLGN中间神经元的一个亚群( 33). PHb的功能表征 氨基丁酸 细胞显示一小部分细胞表现出快速的尖峰反应 Pvalb公司 + 中间神经元，而GABA能神经元亚群表现出准快速的尖峰反应或在最小电流注入下容易进入去极化阻滞。 总的来说，这些结果表明PHb 氨基丁酸 神经元在丘脑内构成一个独特的抑制性中间神经元群。 未来的实验结合功能、形态学和遗传学分析，将正确识别PHb中丘脑GABA能神经元的亚群。 gaba能PHb神经元的一个显著特点是，它们接受iprgc的直接视网膜神经支配，并局部调节兴奋性中继神经元的功能，这与先前描述dLGN视网膜丘脑回路的研究相似( 13, 17). 我们的结果表明，丘脑背侧的gaba能神经元聚集在视网膜受体核、dLGN和PHb内( 32). 因此，我们认为视网膜受体区之间相似的电路基序是保守的，这表明gaba能神经元在调节从背丘脑到皮质区的光信号流动中起主要作用。
gaba能神经元被经典地定义为在时间和空间上同步局部回路中兴奋性神经元的中间神经元( 34). 不像dLGN中的GABA能细胞( 21)，我们发现PHb 氨基丁酸 神经元既有局部投射，也有长程投射。 与其他丘脑背核相比，这代表了PHb回路的一个独特方面( 25, 26). 长程投射GABA能神经元在其他脑回路中也有描述。 例如纹状体中的中等棘状神经元，它们是这个大脑区域的主要输出投射细胞( 35)，小脑的浦肯野细胞( 36)以及连接海马内侧隔的抑制性中间神经元( 37, 38)它们被认为可以调节这些脑区之间的长程同步( 39). 我们的结果显示长程投射的PHb 氨基丁酸 神经元与TRN和Zi形成一个抑制网络。 据推测，来自TRN和Zi的输入可能协调丘脑功能的获得和急性控制，从而影响丘脑皮质信号传导( 18). 进一步的研究将确定不同的抑制性输入源对gaba能和/或兴奋性中继PHb神经元的特征，从而实现丘脑和丘脑皮质的协调通信。
PHb的兴奋性和抑制性信号每天都有变化 PHb神经元在控制这些回路中抑制性和兴奋性传递平衡的基因表达上每天都会发生变化。 PHb中的兴奋性和抑制性神经元都表现出光反应性，这表明环境光的日常变化可能会使PHb电路同步化。 我们建议PHb 氨基丁酸 电路通过ipRGC和丘脑输入分别集成外部和内部信号，以临时协调控制PHb电路和输出信号整体功能的每日振荡( 图6). 我们发现慢性暴露于不规则的明暗周期会在PHb的组织水平上扰乱日常基因表达。 这些结果与在T7周期下观察到的小鼠SCN节律功能的保存形成对照( 11)这表明PHb神经元对光照条件下的不规则变化特别敏感。 T7周期曝光选择性地影响PHb的光响应性 氨基丁酸 神经元。 因此，我们建议在这些不规则条件下，PHb 氨基丁酸 神经元不断地接收来自ipRGCs和丘脑网络的去同步信号，扰乱了外部和内部线索的整合机制。 因此，兴奋性中继PHb神经元的时间抑制性调制被扭曲，导致输出信号改变和情绪相关的缺陷( 图6).
图6 . 描述PHb内兴奋和抑制信号的模型。
提出的模型描述了神经元PHb网络编码和处理光信息在小鼠在正常条件下（顶部）或当光照条件变得长期不规则（底部）时的光信息。
总之，这些结果描述了丘脑PHb内的视网膜受体抑制回路，该回路处理每日光照变化，以调节控制情绪的丘脑皮质回路。 情绪变化是许多神经精神疾病中常见的症状，包括严重的抑郁和季节性情感障碍( 2). 揭示光影响行为的细胞途径将阐明神经精神障碍中导致情绪失调的先前未被确认的因素，并可能最终导致治疗光诱导的情绪和情感障碍的创新策略。
材料和方法 动物 成年小鼠（~3个月大）被安置在22°C的温度下，可以随意获得食物（标准食物）和水。 混合背景野生小鼠（B6129SF1/J，库存编号101043）， GAD2 Cre公司 （库存编号019022），以及 GAD2 麦克里 （库存编号023140）从杰克逊实验室获得。
所有的动物都是按照国家精神卫生研究所动物护理和使用委员会的指导方针来处理的。 所有的努力都是为了尽量减少动物的痛苦和使用动物的数量。 在适当的情况下，实验是随机的，研究者在实验和结果评估中对分配是盲的。 雌性和雄性小鼠被用于解剖学、电生理学和RNA序列研究。 只有雄性小鼠被用于行为研究。
放射性测量 单笼小鼠暴露于规则的光-暗周期（T24，12小时光照：12小时黑暗）下1周以适应环境。 随后，动物被关在T24周期或不规则光周期（T7周期）下2周。 超正电子T7周期包括3.5小时的光照和3.5小时的黑暗； 光强度约为500勒克斯（由KOR 3500 K荧光灯泡提供），使用测光仪（ExTech lux测光仪，401025）测量。 在整个实验过程中，使用安装在笼子顶部的微型发射器（Respironics）的红外运动探测器（IR）监测老鼠的一般活动。 使用VitalView软件（Mini Mitter，OR）在5分钟的垃圾箱中收集数据。 使用ClockLab（Actimetrics，IL）计算总活动和周期长度。 昼夜节律周期长度是通过使用Clocklab（Actimetrics-IL）对10天内的活动集拟合一条回归线来确定的。 最后，根据动物个体的运动活动性计算CT，以CT12为活动起点。
立体定向注射 用异氟醚麻醉小鼠，立体定向注射AAVs或gΔ狂犬病。 坐标是根据帕希诺斯和富兰克林鼠标地图集确定的( 40). PHb的坐标是 ? 1.67毫米（距布雷格马）， ? 3.23毫米（腹侧），和±0.67毫米（外侧）。 将10μl微柱移液管拔出并装填。 使用微量注射器（Drummond科学公司的Nanojector III）进行注射。 手术过程中使用了一个加热垫来维持动物的体温。 术前给予全身性镇痛药（美洛昔康0.1mg/kg；勃林格英格尔海姆）。 在切口处施用局部镇痛剂（利多卡因，2 mg/kg；Fresenius Kabi）。 为了进行解剖学分析，在注射后不同时间（注射AAV后4周或gΔ狂犬病后5天）向小鼠心脏内灌注4%多聚甲醛，然后在冷冻器上切片。 在使用gΔ狂犬病病毒的实验中，灌注后2小时后解剖视网膜。 具有启动细胞（GFP）的动物 + tdT公司 + )仅位于PHb的研究； 当在非PHb区域也观察到启动细胞时，将小鼠排除在分析之外。
使用了以下病毒：
?AAV2/9-phSyn1（S）-Flex-TD番茄-t2a-SypEGFP-WPRE（波士顿儿童医院病毒核心）
?AAV5-EF1a-DIO-hChR2（H134R）-EYFP WPRE pA（UNC矢量核）
?retroAAV-EF1a Nuc-flox（mCherry）-EGFP（Addgene，#112677）
?AAV8/hSyn-FLEX-TVA-P2A-GFP-2A-oG（索尔克病毒核心，）
?EnvA G-删除狂犬病mCherry（Salk病毒核心，32636）
?pAAV5-hSyn-DIO-hM3D（Gq）-mCherry（Addgene，#44361）
?AAV5 hSyn DIO mCherry（UNC矢量核）
?AAV2-CAG-ChR2-GFP（UNC矢量核）
视网膜注射 通过玻璃体内注射（1μl）霍乱毒素β亚单位（CTβ）荧光共轭示踪剂（Alexa fluorphores，thermofisher Scientific）观察视网膜脑投射。 用异氟醚麻醉小鼠，置于立体显微镜下。 给药局部镇痛剂（利多卡因，2 mg/kg；费森尤斯卡比）。 使用玻璃针（拉出10μl微柱管，Sigma-Aldrich P0674）和10μl Hamilton注射器将溶液打入眼睛的玻璃体腔，以确保将溶液输送到视网膜。 老鼠在加热垫上注射后恢复，直到他们从麻醉中醒来。 注射后，给动物3到4天的恢复期。 用4%多聚甲醛对小鼠进行心内灌注，收集脑组织标本。 大脑在同一固定液中固定过夜，然后用低温恒温器获取大脑切片。
组织学/解剖学研究 对于所有的研究，除非另有说明，否则样本采集时间为CT14，即活动开始后2小时。
免疫荧光 大脑切片和视网膜在0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）和3%山羊或驴血清（Vector Laboratories）和0.3%Triton X-100（Thermo Fisher Scientific）中培养2小时，然后使用以下抗体在4°C下培养1至2天：兔子α-GABA（Sigma-Aldrich A-2052；1:500）， 鸡α-GFP（AbCam Ab13970；1:2000）、兔α-c-Fos（细胞信号2250S；1:2500）、兔α-Opn4（高级靶向系统AB-N38；1:1000）、小鼠免疫球蛋白G1α-SMI32（BioLegend 801701；1:200）、山羊α-Td番茄（LS-C340696；1:1000）、山羊α-nNOS（AbCam ab1376；1:300）、兔α-VIP（ImmunoStar 20077；1:1000）， 兔α-NPY（半岛实验室T-4070；1:500）。 洗涤步骤后，使用Alexa结合二级抗体（Invitrogen；1:1000）在室温下持续2小时。 最后，用flulomount-G和DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）（Invitrogen）固定载玻片。 图像是用日蚀Ti2倒置显微镜（Nikon）获得的。
光介导c-Fos诱导 小鼠被关在T24或T7周期下2周。 然后在黑暗中保存1天，以避免光照的任何急性影响。 在活动开始后两小时（CT14，根据运动活性进行测量），使用23-W紧凑型荧光灯泡（GE Daylight FLE10HT3/2/D）对小鼠进行15分钟的光脉冲（1000勒克斯）。 然后将小鼠置于黑暗中90分钟，最后用4%多聚甲醛经心灌注。
伊玛里斯 在imaris9.2.1上打开图像，绘制三维图像，然后在td番茄和Syn-GFP信号上创建独立的曲面。 td番茄的表面粒径为0.01μm，并调整阈值以覆盖染色并显示精细的神经元过程。
核糖核酸酶原位杂交 用70%乙醇和核糖核酸酶抑制剂（Fisher Scientific）清洁工具、载玻片和设备。 用颈椎脱位法安乐死小鼠，快速解剖大脑，用2-甲基丁烷在干冰上冷冻20秒，然后将大脑储存在 ? 80°C直到剖切。 使用冷冻恒温器（徕卡）切片，切片（16μm）安装在显微镜载玻片上。 包含节段的幻灯片存储在 ? 80℃至原位杂交处理。 RNAscope程序根据高级细胞诊断用户手册进行。 载玻片用10%中性缓冲福尔马林或4%多聚甲醛在4°C下固定20 min。随后用PBS洗涤载玻片两次1 min，然后用50%乙醇（1×5 min）、70%乙醇（1×5 min）和100%乙醇（2×5 min）脱水。 载玻片在100%乙醇中培养 ? 20°C过夜。 第二天，在室温下干燥载玻片10分钟。使用疏水笔在切片周围绘制疏水屏障并使其干燥10至15分钟。然后在室温下用蛋白酶预处理-4溶液培养切片20分钟。 用ddH清洗载玻片 2 O（2×1分钟），然后在HybEZ烤箱（高级细胞诊断）中用适当的探针培养2小时。 使用的探针是从高级细胞诊断公司购买的，如下所示： Slc32a1型 （319191-C3）， Slc17a6型 （319171-C2）， Gad1型 （200951年）， Gad2 （439371-C2）， Gabra5型 （319481-C3）， 格林2A （481831年）， 凸轮2A （445231-C3）， Gabra2型 （435011）， Pvalb公司 （421931年），以及 不锈钢 （404631）。
慢性乙型肝炎的控制 氨基丁酸 功能 GAD2 Cre公司 小鼠被立体定向注射 Cre公司 -PHb区依赖性AAV5/DIO-hM3D-mCherry（Addgene）或AAV5/DIO-mCherry（Addgene）（双侧注射）。 小鼠在T24光-暗循环下，用常规食物和水恢复4周。 4周后，给小鼠饮用水中溶解的CNO。 为了实现慢性激活，给小鼠水+CNO 14天，每天更换新鲜溶液（每天8毫升）。 每天测量水和CNO的消耗量，以确保适当的饮用行为和CNO处理。 在CNO治疗期间，将单体小鼠置于T24周期。 2周后进行行为测试。 用红外传感器监测小鼠的一般活动，并在活动期，即CT12和CT14之间进行行为测试。
行为测试 所有的行为测试都是在国家心理健康研究所的啮齿动物行为中心进行的。
强迫游泳试验 强制游泳试验程序如前所述( 11). 简单地说，把老鼠放在一个不可逃避的水容器里6分钟，用一个摄像机监测行为反应，摄像机位于仪器前面，由两名实验人员进行盲目评分。 计算试验最后4分钟的静止时间并用于分析。
尾部悬挂试验 用胶带把老鼠的尾巴吊起来。 两个动物同时被测试，有一个白色的房间防止它们之间的相互作用。 在停药6分钟时记录小鼠的活动。在实验结束时，将老鼠放回它们的笼子里。 静止时间由两名实验者根据先前描述的标准进行盲目评分( 41).
新颖抑制喂养试验 实验开始前，老鼠被剥夺食物24小时。 测试是在一个新颖的环境中进行的，这是一个开阔的场地（60厘米×60厘米的正方形，有黑色的墙壁），明亮的灯光（~500勒克斯）。 一个食物小球被固定在一个小平台上，放在竞技场的中心( 42). 实验开始时，一只老鼠被放在离实验者位置最近的角落里。 实验记录了老鼠吃小球的潜伏期，即动物坐在它的腋下咬一口的潜伏期。 试验持续10分钟。试验结束后，将小鼠转移回其家中的笼子，并测量5分钟内消耗的食物量。 测试是用一个顶置式摄像机拍摄的，视频文件被用来跟踪鼠标的位置使用Ethovision XT软件（Noldus）。
RNA分离与测序 T24或T7周期的小鼠在解剖前在黑暗中放置1天，以消除光的任何急性影响。 大脑被分离，并将其腹侧朝上放置在冰冷的冠状切片脑基质上（肯特科学）。 用冰冷的剃须刀刀片在视交叉的尾端切取1毫米冠状切片。 收集PHb组织，立即置于冰镇醋酸纤维素溶解剂（Qiagen）中，保存于 ? 80例双侧PHb组织样本从4只小鼠中收集，每个重复共4个重复。 按照制造商的说明，使用Qiagen RNEasy脂质组织微型试剂盒进行RNA分离。 用Ovation RNA序列系统V2（Tecan）从总RNA中制备cDNA，并用NEBNext末端修复模块（新英格兰生物实验室）进行末端修复。 用TruSeq链RNA试剂盒（Illumina）从末端修复的cDNA中制备RNA序列文库。 在对Illumina NovaSeq 6000进行测序之前，以等摩尔比率将库集中到每个库的最小深度为1.28亿个150-碱基对对末端读取。
生物信息学分析 利用星型定位仪（v2.4.2a）将RNA序列标记到小鼠基因组（mm10）。 基于负二项分布和Wald显著性检验的差异基因表达分析使用R软件包DESeq2（版本1.28.1）进行，并可视化为火山图。 采用Benjamini-Hochberg方法进行标准多重检验校正，以控制差异表达基因的错误发现率（FDR）。 附加分析和可视化使用标准化计数数据，这些数据是通过使用DESeq2包函数对每个条件的表达式数据进行第一次求和而提取的。” 皱襞 ，”然后执行日志 2 用包函数从拟合的离散均值关系得到方差稳定化变换 变化稳定性转换 .” 为了推断差异上调基因的功能相关性，我们利用数据库对VST标准化计数进行基因本体分析，以便进行注释、可视化和综合发现。
如前所述，我们利用GSEA获得基因表达数据库的生物学洞察力( 27). 使用分子特征数据库v.7.4（数据库：C5.go.bp.v7.4）中提供的一组先验定义的基因，对不同实验组的标准化RNA序列计数进行询问( 43). 具有统计学意义的基因集富集截止值<0.05。
定量聚合酶链反应 PHb组织样本被（双侧）解剖并立即在1.5毫升DNA管（Eppendorf，目录号022431021）中快速冷冻，然后储存在 ? 80°C。根据制造商的说明，使用RNeasy微型试剂盒（Qiagen，目录号74004）和柱内DNA酶（脱氧核糖核酸酶）处理进行RNA分离。 电运动组织匀浆后，将PHb样本汇集在一起( n =2只小鼠/池）在RNeasy MinElute旋转柱中，结果AAV/Feardd和AAV/对照注射样品共有三个混合生物复制品。 分离的RNA通过RNA带站进行质量和浓度评估。 随后，按照制造商对上标IV VILO（Thermo Fisher Scientific，目录号11756050）的说明，使用每个样品总共200 ng RNA制备cDNA。 qPCR反应化学和热循环程序按照制造商关于TaqMan Fast Advanced Master Mix的说明（Thermo Fisher Scientific，目录号4444556）进行。 所有qPCRs在QuantStudio 3平台（Applied Biosystems，Design&Analysis Software version 1.4.3）上使用小鼠特异性TaqMan引物，一式两份运行。 最后，用比较C（T）法（2）测定相对基因表达 ? ΔΔct ).
全细胞电生理学 在所有研究中，样本都是在CT14和CT16之间（活动开始后2到4小时）采集的。 小鼠被麻醉，随后被斩首。 快速取出大脑，并将其置于含92 mM NMDG、20 mM Hepes、25 mM葡萄糖、30 mM NaHCO的冰冻NMDG切割液中 三 ，2.5毫米KCl，1.2毫米NaPO 4 饱和95%O 2 /5%一氧化碳 2 渗透压为303至306 mOsm（Wescorp）。 大脑被快速粘在一个平台上，平台上装有冰冷的NMDG切割液，并在一个leicavt1200振动仪内。 以0.07 mm/s的速度切割250μm厚的含PHb的冠状切片。切片后，将切片置于含有NMDG基切割液的培养箱中，在34°C下培养5至10分钟。随后将切片转移到装有95%O饱和人工脑脊液（aCSF）的腔室中 2 /5%一氧化碳 2 含有92 mM NaCl，20 mM Hepes，25 mM葡萄糖，30 mM NaHCO 三 ，2.5毫米KCl，1.2毫米NaPO 4 （303至306 mOsm）室温下至少1小时。 切片保留在这种溶液中，直到被转移到记录室。
如前所述，进行全细胞膜片钳电生理研究( 44, 45). 对于记录，用泵（世界精密仪器）以每分钟1.5至2.0毫升的流速向记录室灌入含有126毫米NaCl、2.5毫米KCl和1.4毫米NaH的aCSF 2 人事军官 4 ，1.2毫米氯化镁 2 2.4氯化钙 2 25毫米NaHCO 三 ，和11 mM葡萄糖（303至305 mOsm）。 在倒置的Olympus BX5iWI显微镜上使用红外差分干涉对比光学技术观察细胞。 用一个多灯700B放大器（分子器件）对神经元进行电压钳制。 数据在2千赫时被过滤，在20千赫时用1440A数字转换器（分子器件）数字化。 串联电阻（10至20兆欧）使用 ? 5毫伏电压阶跃。 串联电阻变化大于20%的细胞从进一步分析中剔除。
对于GABA-A受体介导的光生诱发IPSC（oIPSCs）的生物物理分离，我们使用玻璃微电极（3至5兆欧姆），其中含有117 mM甲基磺酸铯、20 mM Hepes、0.4 mM EGTA、2.8 mM NaCl、5 mM TEA Cl、4 mM Mg三磷酸腺苷（ATP）、0.4 Na-三磷酸鸟苷（GTP）和5个QX-314（280至285 mOsm）的玻璃微电极。 用DNQX（10μM）和AP-5（50μM）阻断快速兴奋性传导，记录0 mV时sIPSCs和mIPSCs。 GAD2 Cre公司 将AAV5-EF1a-DIO-ChR2-eYFP注入PHb（60 nl）。 在0毫伏的保持电位下，用PE-300冷LED（1毫秒脉冲持续时间；3至60毫瓦）诱发oIPSCs。 从PHb建立OIPSC 氨基丁酸 我们首先在TTX（1μM；Tocris）中冲洗5min，然后用TTX和4-氨基吡啶（50μM；Sigma-Aldrich）冲洗神经元。 用于比较PHb 氨基丁酸 在对照组和T7组动物之间，首先用30mw的刺激强度建立稳定的oIPSC，并记录大约5min。随后，通过递增的刺激强度生成oIPSC输入-输出曲线。 每隔30秒施加一系列刺激（10个脉冲；2、5、10和20赫兹），以确定成对脉冲比和短期可塑性。 细胞间的训练刺激频率顺序是平衡的。 记录后，获得记录位置和eYFP荧光图像。 在一组实验中，切片用4%多聚甲醛固定，以定量T24和T7周期饲养的小鼠的eYFP荧光。
对于固有兴奋性的全细胞记录，我们使用了玻璃微电极（3到5兆欧），其中包括135mM葡萄糖酸盐、10 mM Hepes、4 mM KCl、4 mM Mg ATP和0.3 mM Na GTP，在某些情况下，还有0.1%的生物毒素。 记录当天，将生物毒素（1至1.5%；西格玛-奥德里奇）添加到基于K-葡萄糖酸盐的内部溶液中。 对于内源性兴奋性，在电压钳中膜破裂后，细胞在不保持电流注入的情况下切换到电流钳结构。
量化与统计分析 如前所述，使用G*POWER3软件确定或通过事后分析确定每个实验的样本量计算( 46, 47). 根据从Paxinos和Franklin小鼠地图集获得的视网膜神经分布模式和冠状脑坐标（~到bregma的距离）来确定PHb的头端、中部和尾部( 40)：罗斯特拉尔PHb= ? 1.42至1.62毫米； 中间PHb= ? 1.66至 ? 1.86毫米； 尾端PHb= ? 1.90至 ? 2.10毫米。
使用学生的 t 测试[参数或非参数（Mann–Whitney）]或方差分析，然后进行Tukey或Sidak的多重比较测试，如前所述。 所有的分析都是使用GraphPad Prism 7.0a版完成的。 每个地物图例包含每个比较的统计报告。
