简介
在脑损伤或神经退行性疾病后，迫切需要对退化神经元进行替换(1,2).胚胎或多能干细胞（PSC）衍生神经元的移植是这一方法的前沿，并已成功地实现了临床改善(1–8).从诱导的PSC中获得的神经元更容易获得和可扩展性进一步推动了临床翻译的尝试，例如在帕金森病（PD）患者中(9–11).然而，对于其他神经退行性疾病或生理老化中的神经移植整合，目前知之甚少。
为了修复神经回路的结构和功能，移植的神经元必须正确连接。异常的接线可能会干扰适当的电路功能，尤其是在大脑皮层的疾病中，由于大脑皮层具有高兴奋性驱动力。而神经元移植的输出连通性在很多年前就被发现是非常特殊的(12–17)近年来，对输入连通性的全脑分析以及刺激这些传入物或感觉刺激诱发的神经元活动的活体观察等方面进行了探索(18–22).基于狂犬病毒（RABV）的逆行单突触追踪显示，神经元消融后移植到大脑皮层的胎儿细胞接收来自宿主的全脑输入(18).这些输入与丢失的皮层神经元的输入连接体非常相似(18).基于RABV的追踪和三维磁共振成像的联合注册显示了移植到小鼠不同脑区的人类神经移植的突触整合(23).在中风模型中移植细胞也得到了类似的结果(20,22)，在创伤性脑损伤（TBI）模型中(24)或在PD模型中(21,25,26)尽管全脑输入连接体没有被量化。与急性损伤相反，急性损伤的特点是两个不同的、在某些方面相互抵消的阶段，即促炎性急性期和抗炎性慢性期，在衰老和许多神经退行性疾病中，情况有很大不同，表现为进行性和缓慢性的突触和神经元丢失，以及环境的稳定变化(27–29).急性和侵袭性脑损伤后的反应性胶质增生，如中风和脑外伤(30,31)，与衰老的大脑或阿尔茨海默病（AD）模型有很大不同(32–35).老化或淀粉样蛋白负载的AD大脑呈现出截然不同的宿主环境，移植存活，但它们的连通性仍然未知(36–39).
除了缺乏在这些高度相关的条件下移植的连通性分析之外，新神经元整合到原有电路中的基本原理尚不清楚。移植到成人大脑的研究大多是在神经元缺失的模型中进行的，但是对于神经元的丢失是否是整合新神经元的先决条件却知之甚少。突触丧失通常是神经退行性变之前的第一步，目前尚不清楚它是否以及如何影响新神经元与先前存在但正在退化的回路的整合。此外，反应性胶质增生和炎症对宿主-移植物连接的影响还很少。炎症的影响很难从先前的人类细胞移植研究中推断出来，因为这些异种移植需要免疫抑制(20,22,36,40).为了弄清这些参数对移植连通性的影响，我们在小鼠模型中研究了老化和淀粉样蛋白负荷的脑环境，这些模型没有神经元丢失，但突触丢失，以及不同程度的反应性胶质增生(33,35,41).
衰老的大脑的特点是逐渐的细胞和分子变化，如氧化损伤和线粒体功能障碍，聚集蛋白的积累，轻度炎症伴轻度反应性胶质增生(42–44).这些与年龄相关的变化导致突触丢失，最终导致功能受损和认知能力下降(42).此外，衰老是像AD这样的神经退行性疾病的主要危险因素(45).AD的特征包括错误折叠的淀粉样β肽原纤维在细胞外聚集形成斑块，也引起星形胶质细胞和小胶质细胞增生以及突触丢失，最终导致网络功能障碍和认知障碍(46).因此，了解这些环境如何影响移植神经元的突触整合，以确定突触缺失、反应性胶质增生等基本参数对移植物整合的影响，并阐明其临床意义。
结果
淀粉样变性与衰老小鼠模型的研究
为了探索新的神经元整合到一个病理性更强或较弱且无神经元丢失的环境中，我们分别选择了AD和衰老小鼠模型，并使用同种异体移植，使我们能够探索这些基本原理，同时探索移植物与高度相关的功能障碍环境的整合。首先，我们比较了两种模型中反应性胶质增生的程度。本文所用的APP/PS1小鼠模型在神经元中过度表达人类淀粉样前体蛋白（APP）和早老素1（PS1）(32)大脑皮层缺乏神经元死亡(47).这些转基因小鼠出现早期的脑淀粉样变，伴随着肥大的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的出现，并且在沉积的淀粉样斑块周围显示树突棘的丢失(32,33,48).用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）标记反应性星形胶质细胞和电离钙结合接合器分子1（Iba1）标记小胶质细胞的染色显示，8个月大的APP/PS1转基因小鼠与年龄匹配的野生型（WT）对照动物（C57BL/6J）相比，在8个月大时，APP/PS1转基因小鼠的皮质出现了严重的反应性胶质增生（详见材料和方法；图S1、A和B）。为了进行定量读数，我们评估了小胶质细胞的数量和形态及其突起的长度，发现对照组和APP/PS1小鼠之间有显著的变化。这证实了小胶质细胞的高反应性，小胶质细胞的数量显著增加（图S1、D、E和G），以及其激活状态，与野生型对照组相比，转基因小鼠的分支和分支较少（图S1、D、E和H至J）。
然后我们分析了与AD模型相同背景（C57BL/6J）的16～18月龄WT小鼠大脑皮质胶质细胞的状态。GFAP和Iba1染色显示，与APP/PS1转基因小鼠相比，WT老龄小鼠的皮质反应性要低得多（图S1、B和C）。因此，我们详细的小胶质细胞分析显示，8月龄与16至18月龄野生型小鼠相比，Iba1染色的小胶质细胞数量或突起长度和皮质分支无明显变化（图S1、D、F和G至J）。然而，与对照组相比，老年人小胶质细胞被突起覆盖的体积大的比例明显增高（图S1，K到N）。总之，这项分析显示，与淀粉样病变相比，老年大脑中的反应性胶质增生水平较低，这一比较非常有趣，因为两种模型都显示出突触动力学的改变(43,48,49).
在APP/PS1和老年小鼠中，新生神经元存活并整合到皮层回路中
为了探讨APP/PS1和老年脑的独特细胞和分子环境对移植神经元突触整合的影响，我们使用了我们先前建立的细胞移植、电路图和定量连接组学的范式(18).从胚胎第14天（E14）C57BL/6J胚胎中分离出小鼠皮层细胞，并用编码狂犬病糖蛋白（G）的逆转录病毒转导，该糖蛋白是其逆行转运所必需的，受体TVA（禽肿瘤病毒受体a）允许Env-a假型RABV选择性感染这些细胞(50)一种荧光蛋白（FP；图1A).培养3～5d后，收集细胞移植到8月龄APP/PS1转基因小鼠的初级视皮层（V1）。在这个年龄段，斑块沉积和反应性胶质增生广泛存在（图S1），在没有神经元丢失的情况下树突棘的减少也是如此(32,47).以同一背景（C57BL/6J）的APP/ps1wt窝鼠和同年龄的C57BL/6J小鼠作为对照。作为第三种情况，我们还将细胞移植到16至18个月龄的C57BL/6J小鼠体内(图1A).在以前的研究中，我们没有发现在体外培养和感染的细胞或从E18皮层急性分离的细胞的输入连接体中有任何差异Emx1Cre/G-TVA/GFP型移植前转基因小鼠(18).为了确保在这里测试的宿主环境中也是如此，我们还用急性分离的E18皮质细胞进行了一些移植（图S2G）。移植后5周的分析显示，供者细胞在这三种情况下均存活良好，移植体大小和体积无差异(图1，B至D，以及图S2，A至E）。
为了追踪在所有条件下移植的突触输入，我们注射了EnvA假型和G-缺失RABV(50)表达绿色荧光蛋白（GFP）或mCherry[称为红色荧光蛋白（RFP）]，取决于供体细胞的荧光。这允许在4wpt时选择性靶向表达TVA的供体细胞，随后1周进行电路分析(图1A).我们通过将改良的RABV注射到未移植的WT小鼠的V1中，移植只表达TVA受体和RFP而不表达G蛋白的细胞，然后注射RABV，以确保跨突触追踪的可靠性（图S3）。我们只检测到双重标记的供体细胞（RFP+/绿色荧光蛋白+)但在老年人或APP/PS1移植物皮质中没有发现突触前伴侣（图S3），表明RABV的传播是特异于表达G蛋白的细胞。
然后我们将表达TVA和G蛋白的细胞与FP一起移植到实验条件下。被RABV感染的移植物细胞被称为启动细胞，并且在任何情况下都存在于移植物中[RFP]+/绿色荧光蛋白+;图1，B到D′之间;关于每只鼠的启动细胞的确切数量和条件，参见图S2（F和G）]。移植体周围有绿色荧光蛋白+追踪神经元，即输入神经元（或RFP+输入神经元，取决于供体细胞类型和相应的RABV）。然而，在转基因APP/PS1和WT衰老小鼠的皮质中，这些数量明显增多(图1，B至D).因此，移植的神经元在没有任何先前神经元丢失的情况下存活并整合到这些大脑环境中。
淀粉样斑块负荷皮层神经元移植物的过度局部连接
接下来，我们量化了追踪到的神经元在整个大脑中的分布，以及它们到视觉皮层移植物核心的平均距离(图1、E和F)控制远程跟踪中的任何更改或这些主机环境中的任何意外影响。值得注意的是，在实验组之间，局部追踪神经元的分布范围和距离无法区分(图1、E和F).然后我们计算了大脑范围内的输入连通性，用连通性比（CR）表示，如前所述(18).在一个特定的脑区输入神经元的数量除以启动神经元的总数（RFP+/绿色荧光蛋白+)在移植物内计算CR，并允许在小鼠和条件之间进行比较。启动神经元的数量在移植后有所不同，但在不同的实验条件下没有系统性的差异（图S2，F和G）。共绘制了26个大脑神经区域(图2A)，所有已知的激活V1(51,52)，表明在所有这些情况下都没有异常连接。我们认为这是对AD患者和老年人进行细胞治疗的重要发现。
大多数输入来自局部视觉皮层（Vis）神经元，在这个区域中，CR最高(图2A)，就像幼稚鼠大脑中的V1神经元一样(18,51,52).对照组这个解剖区域（相对于移植物，区域内）的CR与先前使用相同的追踪技术和分析管道测量的该区域内内源性连接的CR非常相似。相反，在APP/PS1转基因小鼠中，这种局部神经支配显著增强(图2，A和B)其他区域和V1的主要传入物丘脑背外侧膝状体核（LGN）则不同(51)与WT对照组相比，APP/PS1的LGN-Vis连通性无显著差异(图2，A和C).值得注意的是，其他高斑块沉积的皮质区域的CR，如RS、PtPa、SS、MO、Aud、ECT、ENT、Tea和Orb（见图2A)APP/PS1与相同年龄、相同群体和背景的对照WT脑具有可比性(图2D).对侧半球也是如此(图2E;关于每只老鼠和大脑区域追踪到的神经元的确切数量，见数据S2）。因此，在淀粉样斑块负荷的皮层，移植物的局部输入被特别增强。这与神经支配区的斑块负荷无关，因为观察到来自具有类似斑块负荷的其他皮质区域的相对正常连通性。然而，值得注意的是，低CR区CR变化的统计意义可能被忽略，因此只有在某些动物中才有追踪到的神经元。
衰老小鼠大脑皮层神经元移植物的过度皮质连接
为了确定上述发现是否与APP/PS1条件有关，我们检测了16-18月龄WT小鼠大脑皮质中相同供体细胞的突触整合。与8个月大的WT对照组小鼠相比，老化皮质的视内宿主-移植物连接显著增加(图2，A和B).视觉皮质CR与转基因APP/PS1小鼠的视觉皮质CR相似，但个体间差异较大。此外，我们还注意到，只有在老年人的大脑中，其他皮层区域的CR也显著增加(图2D).此外，LGN输入的平均CR比对照组高5倍，但由于个体间差异较大，未能达到统计学意义(图2C).相反，大脑半球间的连通性与对照组和其他实验组相当(图2E;关于每只鼠和大脑区域追踪到的神经元的确切数量，见数据S2）。总之，在两种宿主环境中，移植的神经元从局部或整体皮层回路接收过多的输入。出乎意料的是，与8个月大的APP/PS1转基因小鼠相比，衰老的皮质（即轻度胶质增生模型）在移植物连接方面表现出更广泛的影响，尽管老龄小鼠个体间的更高变异性促使我们仔细考虑这些结果。
皮层环境诱导宿主-移植物超连接的蛋白质组学综合分析
考虑到两种情况下的连通性差异以及胶质增生程度的不同，我们使用无偏蛋白质组学来了解导致移植物过度连接的环境成分。从5只8个月大的转基因APP/PS1和9只C57BL/6J小鼠（4个老化体重组和5个体重8个月大的对照组）的两个大脑半球的视觉皮质中收集组织穿孔，即移植的时间和确切年龄。最先进的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）可重复检测5368种蛋白质。在转基因APP/PS1组织样品中，与WT年龄匹配的对照样品相比，转基因APP/PS1组织样品中显著富集了约7.2%，即384个蛋白质(图3A;详见表S1AP价值观）。正如预期的那样，淀粉样βA4蛋白（APP）在APP/PS1转基因小鼠的皮层中明显丰富(图3A)，与这些小鼠Thy1启动子下的过度表达一致(32).进一步验证了淀粉样变的模型，β-分泌酶1（Bace1），这是一种已知的启动APP加工并在斑块周围积聚的蛋白质(53)，也显著增加（表S1A），这可以通过在斑块区域周围进行免疫染色得到证实（图S4）。与这些小鼠淀粉样蛋白沉积上显著的反应性星形胶质增生一致(47,48,54,55)波形蛋白（Vim）和GFAP显著升高(图3A).在反应性胶质增生的同时，我们检测到细胞外基质（ECM）的差异调节成分，如vitronectin（Vtn）和一些整合素样整合素β2（Itgb2）。经典补体系统的成员，补体C4-B（C4b）和补体亚组分C1q，亚基a、B和c（C1qa、C1qb和C1qc）在APP/PS1组中显著富集(图3A)免疫染色也证实了这一点(图3，F、G和I).基因本体（GO）术语分析证实了这些发现，显示除了C1qc、C1qb和C1qa外，“补体激活，经典途径”和“突触修剪”显著丰富，包括免疫球蛋白κ常数（Igkc）、免疫球蛋白重常数γ2b（Ighg2b）和整合素α（Itgam）(图3B以及表S1B）。最重要的GO术语都与免疫系统和炎症过程有关，例如“免疫应答”，包括C1qa、C1qb、C1qc、clusterin（Clu）、APP、信号转导和转录激活因子1（Stat1）或免疫相关鸟苷三磷酸酶家族M蛋白1（Irgm1）等。因此，炎症和免疫反应可能有助于通过补体系统激活小胶质细胞介导的突触清除(56,57).与淀粉样变过程中的突触功能障碍和丢失一致，APP/PS1样本中与神经元活动和突触功能相关的蛋白质，如富含亮氨酸重复序列和纤维结合蛋白3结构域的蛋白质2（Lrnf2）和谷氨酸盐致离子受体红藻酸钠型亚单位5（Grik5）显著下调(图3A以及表S1B）。在下调蛋白的重要GO术语中，有一个是“RNA剪接的正调控”，鉴于剪接对神经元功能的重要意义，这可能导致神经元功能障碍。
将17个月龄WT小鼠和8个月龄WT对照小鼠的皮质样品进行比较，发现175种蛋白质的丰度存在显著差异(图3C;详见表S1CP因此，只有APP/PS1皮层中受显著调控的蛋白质总量的一半左右。在老年皮质中，ECM的一些成员也显著增加，但与APP/PS1皮质中的不同，如透明质酸和蛋白多糖连接蛋白2（Hapln2）、层粘连蛋白和胶原。Bace1在这种情况下也显著增加，免疫染色也证实了这一点（图S4）。下调蛋白的GO术语显著丰富，其中包括几种肽酶抑制剂的“蛋白水解负调控”。在丰富的蛋白质中，也在老年皮层中，GO术语“补体激活，经典途径”显著富集，包括Igkc、Ighg2b等蛋白质(图3、C和D，和表S1D），以及其他一些，例如免疫反应中涉及的Igμ链c区（Ighm）(58).其他重要的GO术语与免疫系统有关，同样包括Igkc、Ighg2b和Ighm等蛋白质(图3D).此外，突触蛋白如巴松（BSN）或突触素（Synpo）也被发现下调(图3C).总之，免疫调节、补体激活和突触丢失是衰老和淀粉样蛋白负荷皮质共同的特征。
为了确定与过度移植连通性相关的因素，我们检测了在两种促进连通性的环境中调节的蛋白质，如Bace1(图3E以及图S4）。我们注意到，术语“吞噬，识别”通常是丰富的，它包括补体系统相关蛋白Igkc和Ighg2b，以及Igγ-2B链C区（Igh-3）和胶原α-1（II）链（Col2a1；表S1、E和F）。许多常见的调节蛋白与突触功能和补体系统有关，如C1q，在AD小鼠模型中参与早期突触丢失(56)在衰老的大脑里(59,60).免疫染色证实了在斑块负荷和老年大脑皮层中C1q水平的增加(图3，F至H)后者有一个斑驳的外观，这是以前报道过的(59).在APP/PS1皮层中，C1q显著而均匀地增加(图3，G和I)这也解释了为什么它在APP/PS1皮层的蛋白质组中显著富集，而在衰老的皮层中却没有，因为它只在斑块中出现(图3，H和I).C1q斑块状及相应的突触丢失可能与老年宿主脑中宿主-移植物连接的高变异性有关。总之，这一分析暗示了C1q蛋白的上调和相关突触的丢失，这可能是受体脑实质中传入信号可用性增加的一个可能原因，受体实质准备与完全胜任的移植年轻神经元连接，而不是与患病和衰老的内源性神经元相连。
讨论
在这里，我们研究了移植的胎儿神经元与受淀粉样变性影响或在衰老过程中改变的脑回路的整合。这表明，在这两种情况下，局部神经元都有过多的神经支配，此外，老年小鼠的其他皮层区域也有过多的神经支配。这是一个明显不同的结果，与对照组或年轻小鼠受皮层损伤和轻微炎症反应，其中新的连接在数量上类似于天真的连接(18).
技术考虑因素
在评估基于RABV追踪的新见解之前，重要的是要考虑技术方面的问题。例如，G蛋白的表达可能受到淀粉样变或炎症的影响。为此，我们应用β淀粉样蛋白（Aβ1–42岁)纤维和炎症刺激物，如脂多糖（LPS）、干扰素-γ或白细胞介素-1β，被G蛋白表达病毒感染后我们通常移植的细胞（图S5）。G蛋白的免疫染色和信号的定量显示，尽管在体外有这些明显的刺激，G蛋白水平相似（图S5H）。因此，炎症或淀粉样蛋白不能调节鸡β-肌动蛋白启动子（CAG）表达的G蛋白水平。
此外，我们实验组的神经元活动可能有所不同，假设静息突触和活动突触对RABV的传播有差异。淀粉样蛋白负荷的大脑有越来越多的沉默和过度活跃的神经元，后者位于斑块附近(61,62).在8个月大的APP/PS1转基因小鼠中，多动神经元和沉默神经元的平衡出现在早期阶段。虽然神经元活动水平的改变可能与移植神经元和内源性神经元之间的突触竞争高度相关（见下文），但这些改变并不能调节G蛋白水平(63).阻断动作电位或促进突触传递对G蛋白水平或单突触RABV追踪均无影响(63).因此，我们的结论是，G蛋白水平不太可能改变，并且在这里检查的条件下主要影响输入追踪。
移植神经元整合的基本原理
我们的工作阐明了将新神经元整合到脑回路中的几个基本原则，首先证明神经元丢失不是先决条件。8个月龄时，APP/PS1转基因小鼠大脑皮层无神经元丢失(47)在衰老的野生型小鼠中(64,65)然而，新的神经元接收到的连接比先前神经元丢失的模型还要多(18).这种效应仅限于APP/PS1小鼠的局部连通性，因此与遍布大脑皮层的淀粉样斑块负荷没有直接关系。然而，值得注意的是，斑块负荷在海马体和视皮层等后部区域最高(66)因此可能与在视觉皮层观察到的更高的局部输入有关。在老化的大脑中，额外的输入也来自其他皮层区域，这意味着在这种环境下，过度连接的原因稍微更加明显和广泛，因此，至少在这种情况下，与斑块负荷无关。然而，反应性星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化和扩张所监测到的反应性胶质增生程度也不是输入连接组的主要预测因素和决定因素。在轻度胶质增生的情况下，正常老化的皮质和富含淀粉样蛋白的皮质中，星形胶质细胞和小胶质细胞数量/活化水平更高，这一点也同样过度。
由于这些情况和随后发生的胶质增生在分子水平上有所不同，我们通过无偏蛋白质组分析，探索了哪些因素可能使这些大脑环境有利于对移植神经元的过度输入。补体途径和免疫系统的激活是这两种环境中最显著的共同特征，可能是观察到的超连接的关键。补体激活在标记小胶质细胞消除的突触中有着很好的作用(56,67,68)在这些免疫激活的环境中，这一过程可能会得到加强(56,69).在APP/PS1转基因小鼠中敲除C1q会导致神经病理学的降低，尤其是活性降低的胶质细胞，这表明C1q也有助于胶质增生(70).突触丢失是由补体上调介导的(56)在衰老过程中，C1q蛋白的增加与猕猴前额叶皮层的突触后位点有关(71).因此，我们认为，在老化和淀粉样蛋白负荷的大脑中，由炎症和补体激活介导的突触丢失，而不是神经元的丢失，会促进移植神经元的过度输入连接体。
神经元活动在突触形成和突触可塑性中起着关键作用，被认为是齿状回成年神经元整合的突触竞争机制(72–75).移植后，就像成人神经发生一样，特别活跃和易兴奋的新神经元与先前存在的神经元和突触竞争。因此，与先前存在的神经元上的突触相比，在移植神经元上形成的突触可能更具优势，因为突触后活性更高。因此，比起病理环境中预先存在的神经元，有利于移植神经元的活动依赖机制可能有助于移植到淀粉样变性和老年环境中的神经元的过度神经支配。同样，在淀粉样蛋白负载的大脑和正常老年大脑中观察到的相似的高连接水平证明了APP/PS1小鼠突触兴奋和抑制之间不平衡的主要作用(61).同样，在宿主环境的V1中，我们无法检测到parvalbumin染色的中间神经元数量的任何差异（图S6），因此排除了它们选择性死亡作为改变兴奋/抑制平衡的主要因素。
