技术干货：人源化小鼠模型的构建和应用（节选）

小鼠疾病模型是药物研发、基因治疗中重要的一个环节。常见的人源化敲入基因是 cDNA，而不是基因组DNA。删除内含子或可简化基因编辑策略和降低成本，但也可能由于调控序列的缺失而导致剪切发生错误。通过基因组敲入将小鼠基因替换为人类同源基因的人源化小鼠模型显示出了更强的人类生理相关性。人源化小鼠模型的构建有哪些类型？

    为了更好地了解人类健康和疾病，研究人员制作了各种携带人类基因的小鼠模型。随着基因编辑技术的发展，在小鼠体内用特定人类基因组序列取代原有小鼠基因组序列变得越来越简单可行：从对单个核苷酸和氨基酸进行的人源化，到包含整条人类染色体的人源化。几十年前研究人员就制作了携带人类 cDNA、 非编码 DNA 的小鼠，现在越来越多的研究人员将这些方法结合起来，有针对性的在小鼠体内将某些基因组 DNA 用人源 DNA 取代，创建“基因敲入”的人源化小鼠模型。

    几十年前研究人员制作携带人类 cDNA、非编码 DNA 的小鼠，多采用将人类基因组 DNA 随机插入的方式，很少数情况下会采用定点敲入的方式将小鼠基因组替换成人类基因组 DNA。现在越来越多的研究人员将这些方法结合起来，有针对性的在小鼠体内将某些基因组 DNA 用人源 DNA 取代，创建“基因敲入” 的人源化小鼠模型。采用定点敲入人类基因组 DNA 的方式在小鼠体内表达人类蛋白，可以更好地模拟人源 蛋白的生理作用，并且避免了由于外源基因随机插入导致的突变、异位表达以及人为造成的过表达，这对 于研究某些剂量敏感型的蛋白功能十分重要。因此，基因组人源化的小鼠模型为人类生物学和病理学提供了更精准的模型，为小分子药物疗法、抗体治疗、基因治疗如 ASO 疗法提供了更精准的测试模型。下面我们将综合讨论基因组人源化的新兴技术以及基因组人源化在人类疾病研究以及药物开发过程中的应用。

人源化小鼠基因的技术和方法

    在过去，经典的创建基因组人源化小鼠的方法是在小鼠胚胎干（ES）细胞中使用质粒载体进行同源重组（HR）的 DNA 打靶（图略，请索取原手册查看），但由于载体插入片段的限制，该技术只能成功应用于小于 15kb 的基因组 片段人源化。最先运用该技术产生的人源化小鼠是表达人源免疫球蛋白 kappa（轻链）和 gamma-1（重链） 恒定区的用来制备人源化抗体小鼠。随着细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、人类人工染色体（HAC）和哺乳动物人工染色体（MAC）的发展，运用“重组酶介导的盒式交换”（RMCE；图 1b） 和“重组酶介导的基因组交换”（RMGE）策略，研究人员可以将更大区域的人类序列引入到小鼠基因组中。 通过 BAC 载体结合 ES 细胞技术的大规模同源重组技术使得人源化全基因、基因簇甚至几百万碱基大小的 基因座成为可能。在产生人类抗体的小鼠中，有几百万个碱基的人源化区域，就是通过这种方法构建而成。

    CRISPR 介导同源重组技术的出现，提高了敲入外源 DNA 时的靶向性和成功率，因而可以直接进行受 精卵注射，减少了筛选 ES 细胞克隆所需的时间和资源，迅速提高了研究人员对啮齿动物基因组进行基因组人源化的能力。CRISPR/Cas9 辅助受精卵中的 HR，使用单链寡脱氧核苷酸（ssODN）作为修复模板（也称为“easiCRISPR”），足以在受精卵中进行高效编辑，并且不会留下基因组编辑痕迹（图 1c）。目前 ssODN 供体的当前大小限制为~2kb，这对于引入小片段的外源基因组 DNA 来说十分方便 具有很大的应用范围。

    CRISPR/Cas9 结合 ssODN 介导的末端连接是人源化基因的另一种新方法，该方法无需同源臂，主要使用一对包含供体模板和靶向位点短同源区域的 ssODN 介导同源重组，因此可以直接在受精卵中操作（图略，请索取原手册查看）。 该方法已经应用于在大鼠中敲入 200kb 的人源 SIRPA 基因组 DNA，同时去除大鼠 Sirpa 同源基因，将 58kb 的大鼠 Cyp2d 基因簇替换成 6.2kb 的人源 CYP2D6 基因。

a. 运用 ES 细胞中进行的 HR 可以将高达~200kb 的基因座进行人源化（重复使用可以人源化更大的基因组片段）。通过电穿孔将携带人类基因组序列以及同源臂的质粒或 BAC 靶向载体转染到 ES 细胞中；同时转染 Cas9：sgRNA 可以产生特定的双链断裂，从而提高 HR 效率；之后，运用抗性基因选择标记可以筛选包含所需的重组的细胞。筛选标记的两侧通常是 frt 位点， 可利用 FLP 重组酶切除后会留下 frt 痕迹。

b. 重组酶介导的盒式交换（RMCE）可用于人源化高达~200kb 的基因座，也可以反复使用从而人源化更大的基因组片段。在 这项技术中，首先利用同源重组（HR）将含异向 Lox 位点以及筛选基因的着陆垫插入目标基因座（参见 a 部分），其次通过 电击将在含有两个异向的 Lox 位点的 BAC 转染入含有着陆垫（landing pad）的 ES 细胞中，在 CRE 重组酶作用下可以将人的基因组片段定点插入目标基因座中。最后，利用 Cas9：sgRNA 将鼠源基因进行删除。着陆垫以及其他外源序列两侧可以加入 PiggyBac 末端重复序列，使用 pigBac 转座酶切除，不会留下任何基因组编辑痕迹。

c. 通过使用 ssODN (~150bp)供体模板和位点特异性 Cas9：sgRNA 介导的同源重组，可以在受精卵中引入短片段人源基因。 使用供体模板长 ssODN (<2kb) 和一对 Cas9：sgRNA，可以实现小基因或部分人源化。

d. 通过 Cas9：sgRNAs 和具有杂合同源序列的 ssODN 供体介导同源重组，能够实现在小鼠和大鼠的受精卵中敲入高达 200kb 的基因组片段。

    按照人源化基因片段大小的区别，可以将人源化小鼠分为以下几种：

a. 人源化特定基因的部分序列
    人源化特定基因的部分序列包含人源化特定氨基酸或者人源化特定位点和外显子。在人类疾病中，某个特定氨基酸或蛋白质位点的突变就足以导致全身性骨骼和肌肉的发育异常，造成某些遗传性的罕见病。 这时候在构建具有相同突变氨基酸突变或位点的人源化小鼠模型对于研究疾病的作用机制以及治疗药物开发非常重要。

b. 人源化特定基因的全部序列及其网络
    在某些情况下，研究人员需要人源化信号通路或网络中的多个基因以更好地模拟人类生物学功能。例如，将人类造血干细胞移植入免疫缺陷小鼠中可以产生具有人类免疫系统的嵌合小鼠；然而，小鼠细胞因子与人类细胞因子受体的交叉反应很差，不足以支持这些人体免疫细胞的成熟和功能。因此，在小鼠中进行细胞因子的基因组人源化，有助于改善小鼠环境中人类单核细胞、巨噬细胞和 NK 细胞的发育和功能。

c. 人源化小鼠中没有的同源基因
    大约 1%的人类基因在小鼠中没有同源序列，在其余99%的同源基因中一些蛋白质的编码基因在两个物种中的拷贝数也可能不相同。 例如，小鼠只有一个 Smn 基因编码运动神经元存活蛋白，但人类有 SMN1 和 SMN2 两个同源基因。 SMN1 和 SMN2 几乎相同，但 SMN2 第 7 号外显子单碱基变化会导致其约 80%的转录本产生不稳定的、截短的蛋白质，仅约 20%的 SMN2 mRNA 能编码有功能的蛋白。因此，在构建 SMA 小鼠模型时，需要将人源 SMN2 敲入小鼠基因组中。

d．人源化整条染色体
    小鼠基因组也可以通过添加整个人类染色体进行基因组人源化，目的是对复杂性疾病进行建模，例如由 21 号染色体三体引起的唐氏综合症。这可以通过微细胞介导的染色体转移，再与小鼠 ES 细胞融合，通过囊胚中形成嵌合体而获得“转染色体”小鼠。该小鼠是人类 21 三体唐氏综合症的疾病模型，携带几乎完整的人类 21 号染色体（Hsa21），是人源化区域最大的小鼠，在行为、突触可塑性、小脑神经元数量、心脏发育和下颌骨大小方面表现出与人类唐氏综合症相关的表型改变。转染色体小鼠是研究人类非整倍染色 体疾病的重要遗传学工具。

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