《Nature Cancer》放疗促进癌症？！

　　

 目前，放疗是癌症患者最常规、最有效的治疗方法之一，约60%的癌症患者接受[1]放疗。

随着放射治疗技术、设备和成像技术的变化，放射治疗的有效性和可靠性越来越高。然而，放射治疗对健康组织的意外损伤仍然是不可避免的。

组织损伤首先引起炎症反应，但随后需要启动组织修复。组织修复(再生)需要抑制炎症免疫反应，这与肿瘤免疫抑制的微环境相似。然而，辐射损伤修复微环境与肿瘤转移的关系尚不清楚。

最近，伦敦玛丽女王大学的Ilaria Malanchi领导的一个研究小组在《Nature Cancer》杂志上发表了重要的发现。

他们发现，照射健康的小鼠肺可引起大量外周血循环中性粒细胞浸润损伤部位，产生与组织修复相关的中性粒细胞反应，并激活Notch信号通路介导的肺上皮细胞，导致肿瘤肺转移。Nexinhib20是一种中性粒细胞脱颗粒抑制剂，又称DAPT，是一种Notch抑制剂，可以有效抑制中性粒细胞介导的肿瘤转移。

 

Malanchi团队之前的研究表明，当乳腺癌转移到肺时，肺组织[2]中会发生一种组织再生。随后，Malanchi团队分析了以往的基础研究和临床研究数据，发现在接受放疗的患者中，乳腺癌病灶同侧肺组织中肿瘤转移的现象更为常见[3,4]。

因此，Malanchi的团队想知道放射治疗对健康组织的意外伤害是否可能促进肿瘤细胞的转移。如果是这样，他们还想知道这背后的分子机制是什么。

为了回答这一假设，Malanchi的团队利用辐射(13 Gy)对肺部造成的急性肺损伤，结合移植肿瘤细胞的小鼠模型，来探索健康组织损伤和肿瘤转移之间的关系。

在辐射诱导小鼠急性肺损伤后，研究人员发现，无论是将肿瘤细胞移植到原位乳腺，还是将肿瘤细胞直接移植到尾静脉，辐射组小鼠的肺部肿瘤数量在移植后14-21天增加，肺组织切片显示肿瘤面积急剧增加。 

为了排除个体差异，他们精确地照射小鼠的右肺造成损伤，然后将肿瘤细胞植入尾静脉。实验数据显示，小鼠右肺叶的肿瘤数量明显高于未辐照的左肺叶。

在辐射导致小鼠急性肺损伤后，Malanchi的团队还通过组织切片染色证实辐射确实会导致组织损伤，比如DNA断裂。此外，他们还发现了一个意想不到的发现:进入损伤肺的中性粒细胞明显增多，呈多叶状核的炎症活化细胞形态，颗粒蛋白含量增加。

为了测试浸润性中性粒细胞是否参与了促进肿瘤细胞转移以定植受损组织，Malanchi的团队采用了一种阳性和一种阴性的策略。

让我们先看看第一种策略。从辐射前一天到实验结束，他们每天给小鼠腹腔注射抗Ly6G抗体以消耗小鼠体内的中性粒细胞。在放射治疗7天后，他们通过小鼠尾静脉注射肿瘤细胞。

在移植肿瘤细胞7天后，他们发现减少中性粒细胞可以有效地抑制已经转移到肺部的肿瘤的生长。

在第二种策略中，他们使用G-csf(粒细胞刺激因子)敲除小鼠作为肿瘤移植受体。G-csf敲除小鼠从照射前一天开始，每隔一天皮下注射外源性重组粒细胞刺激因子(rGCSF) 4次补充GCSF。

放疗7天后，行尾静脉肿瘤细胞移植。肿瘤细胞移植7天后，他们发现注射rGCSF促进肿瘤向肺部转移。

基于以上研究结果，Malanchi团队推测，辐射对健康肺组织的损伤可以预激活浸润性中性粒细胞，从而改变肺微环境，促进肿瘤细胞转移和定植。

为了验证这一猜想，Malanchi的团队设计了一个二次移植实验:首先，让供体小鼠的肺受到辐射损伤，7天后，用抗Ly6G磁珠富集分离浸润肺部的中性粒细胞。

将这些预活化的中性粒细胞转移到正常小鼠体内，通过尾静脉注射肿瘤细胞。

结果表明，预活化中性粒细胞移植小鼠的肺肿瘤数量明显高于对照组。

本实验的结果表明，这一群体的预活化中性粒细胞有能力重塑肺微环境，有利于肿瘤转移。

为了探索预激活的中性粒细胞影响肺部的特定靶细胞群，Malanchi的团队使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞，然后流动分选肺上皮细胞（CD45–CD31–Ter119–EpCAM+）、间充质细胞（CD45–CD31–Ter119–EpCAM-）并进行RNA-Seq测序。 

主成分聚类分析表明，辐射加抗Ly6G抗体注射实验组和单独辐射实验组的样本不能聚在一起。

这表明嗜中性粒细胞的消耗对受辐射的肺上皮细胞有很大的影响。结合体外肺类器官培养模型实验，证实预活化的中性粒细胞能较好地活化肺上皮细胞。

为了探索预活化的中性粒细胞对肺上皮细胞功能的影响，Malanchi的团队深入分析了肺上皮RNA-Seq数据。结果发现，肺上皮细胞的Notch信号通路被预活化的中性粒细胞激活。

为了了解这组Notch信号通路异常激活的肺上皮细胞是否参与了肿瘤细胞的转移，Malanchi团队构建了转基因小鼠(Sftpc-CreER;他莫西芬诱导II型肺泡细胞Notch过表达;Rosa26 NICD-IRES-GFP)。

然后将该小鼠与自发乳腺癌小鼠(MMTV-PyMT)交配，获得能够自发原位乳腺肿瘤和他莫西芬特异性诱导II型肺泡细胞Notch信号通路激活的小鼠模型。

在上述小鼠模型的帮助下，他们发现Notch-过活化的II型肺泡细胞确实可以促进乳腺癌的肺转移。

他们还通过单细胞测序分析证实，Notch信号通路在肿瘤细胞到来之前在受辐射的肺上皮细胞中被过度激活。

考虑到干细胞转录因子Sox9是Notch1[5]的下游靶基因，Malanchi的团队想知道在Notch信号通路过度激活的微环境中，肿瘤细胞本身的干细胞性是否会增强。

他们发现辐射确实促进了Notch信号和转移性肿瘤细胞的干细胞化。

所以，为了这个故事，它必须回到中性粒细胞，这个研究的主角。这组预活化中性粒细胞如何影响肺上皮细胞?

基于先前在中性粒细胞中发现的细胞内颗粒蛋白的增加，Malanchi团队猜测这些颗粒蛋白的释放可能介导了上述过程?

因此，他们提出研究颗粒蛋白不再释放是否可以通过抑制中性粒细胞脱颗粒的过程来影响肿瘤转移。

他们发现，在辐射损伤的肺中，脱颗粒抑制剂Nexinhib20确实逆转了中性粒细胞介导的转移现象。更进一步，他们还使用了中性粒细胞弹性酶(Ela2)敲除小鼠模型，该模型与抑制剂Nexinhib20具有相同的效果。

那么，抑制肺上皮细胞Notch信号通路的过度激活是否也能逆转中性粒细胞介导的辐射损伤肺内肿瘤转移的作用呢?

研究人员使用γ-分泌酶抑制剂DAPT (Notch抑制剂)治疗肺辐射损伤小鼠，发现它能有效抑制肿瘤干，从而抑制肿瘤的转移和生长。

到目前为止，本研究采用放射性急性肺损伤联合自发/移植瘤模型，验证了辐射损伤正常组织(肺)有利于肿瘤转移(肺)的假设。

进一步发现了隐藏的中性粒细胞(颗粒蛋白)-肺上皮细胞(Notch信号通路)-肿瘤干细胞(Sox9)的“兴趣”信息传递链。

利用抑制剂Nexinhib20和DAPT阻断传导链可以有效实现逆转，具有一定的临床翻译意义。

总的来说，Malanchi团队的研究表明，高水平的辐射对健康肺部组织的微环境有深远的影响，这种影响增加了癌症转移到肺部的可能性。

更重要的是，Malanchi的团队发现，辐射刺激的中性粒细胞是促进癌症转移的关键。

应该指出的是，在Malanchi的实验中，健康组织暴露于辐射的体积远远大于临床放射治疗的体积。

因此，本研究不能得出放疗促进肿瘤转移的结论。然而，本研究发现辐射对中性粒细胞有作用，辐射增强转移的能力依赖于中性粒细胞脱粒。

中性粒细胞产生的外泌体可能影响其他区域的微环境，促进癌细胞的转移。

因此，在本研究的基础上，有必要关注放疗对患者中性粒细胞的影响。

最后，我们讨论本研究实验设计的局限性。

临床上，既有原发肿瘤又有肺转移时，患者长期与肿瘤共存。

此时，放射治疗对健康组织的意外损伤促进了肿瘤转移，很难直接区分体内现有的肿瘤是否更适合肺损伤的微环境（因为其中的免疫细胞也被不加区分地损伤），或者损伤会引起炎症（中性粒细胞活化），损伤后修复会影响微环境，甚至辐射疗法带来的机体应激反应，或者其中一些存在。

这与Malanchi团队设计的先损伤再移植外来肿瘤细胞的实验模拟完全不同。因为，在实验设计的辐射造成肺损伤之前，小鼠是没有肿瘤细胞的。

因此，研究团队在讨论部分也强调了这种急性损伤-移植模型有一定的局限性。

此外，清除中性粒细胞(或抑制脱粒过程)对中性粒细胞所承担的免疫和防疫非常有害，因为人体不仅面临肿瘤，还面临细菌、真菌、支原体等微生物的入侵。

根据现有实验数据和背景知识的解读，肺上皮细胞激活Notch信号通路不是没有原因的，而是参与了肺上皮细胞损伤的修复。

如果Notch信号通路被抑制，肿瘤的数量可能会减少，自我损伤的修复会明显延迟。

慢性持续炎症的后果难以预测，如肺纤维化，会导致肺功能下降。这些缺点也将极大地限制临床翻译的应用。

这些有趣的问题值得进一步讨论和研究。癌症被称为“永远不会愈合的伤口”，那么像这样的慢性“损伤”会继续重塑正常的组织微环境吗?除中性粒细胞外，还有其他组织内巨噬细胞参与吗?

期待更多后续研究成果。

引用:

[1] Wirsd?rfer F, Jendrossek V. The Role of Lymphocytes in Radiotherapy-Induced Adverse Late Effects in the Lung. Front Immunol. 2016; 7: 591.

[2] Ombrato L, Nolan E, Kurelac I, et al. Metastatic-niche labelling reveals parenchymal cells with stem features [published correction appears in Nature. 2019 Nov;575(7784):E8]. Nature. 2019; 572 (7771): 603-608.

[3] Vicini FA, Kestin L, Huang R, Martinez A. Does local recurrence affect the rate of distant metastases and survival in patients with early-stage breast carcinoma treated with breast-conserving therapy? Cancer. 2003; 97 (4): 910-919.

[4] Kuonen F, Secondini C, Rüegg C. Molecular pathways: emerging pathways mediating growth, invasion, and metastasis of tumors progressing in an irradiated microenvironment. Clin Cancer Res. 2012; 18 (19): 5196-5202.

[5] Meier-Stiegen F, Schwanbeck R, Bernoth K, et al. Activated Notch1 target genes during embryonic cell differentiation depend on the cellular context and include lineage determinants and inhibitors. PLoS One. 2010; 5 (7): e11481.

Nature Cancer: Radiotherapy makes neutrophils promote cancer?

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