《Science》OpenCell：蛋白质组亚细胞定位

由Chan Zuckerberg Biohub领导的OpenCell项目将内源性标记、活细胞成像和交互蛋白质组学相结合，生成人类蛋白质组的亚细胞图。到目前为止，该项目已经对1300多种蛋白质进行了测量，并确定了5200多种蛋白质之间的29000多种相互作用。它有望为未知蛋白质的表征、高通量筛选以及分化和疾病期间细胞状态建模开辟新的途径。

　　

如果你想了解机器是如何工作的，你需要的不仅仅是零件清单。你需要了解所有部件的位置，以及它们是如何组合在一起的，尤其是当你试图理解一个复杂的机器时——比如人类细胞。好吧，一段时间以来，我们已经有了详细的，蛋白质水平的人体细胞部分列表。这些部分列表或蛋白质组谱有其用途，但当我们试图跟踪生命过程中的质量、能量和信息传递时，它们提供的指导很少。

为了有效地绘制细胞的技术图纸或插图，来自Chan Zuckerberg Biohub的科学家们结合了内源性标签、活细胞成像和相互作用蛋白质组学。用科学家的话来说，这种三管齐下的方法使他们能够“成像活细胞中每个蛋白质的定位，以及给定目标与细胞内其他蛋白质之间的相互作用。”由Manuel D. Leonetti博士领导的科学家声称，他们的工作将促进对人类蛋白质组组织的系统级描述。

这项工作的细节发表在3月10日的《Science》杂志上，题为“OpenCell:人类细胞组织制图的内源性标签”。

“使用高通量CRISPR介导的基因组编辑，我们构建了一个含有1310个荧光标记的[HEK293T]细胞株的文库，”这篇文章的作者写道。“通过使用这个库进行配对的[免疫纯化-质谱(IP-MS)]和活细胞成像，我们生成了一个大数据集，描绘了相应的1310个蛋白质的细胞定位和物理相互作用。将无监督聚类和机器学习相结合用于图像分析，可以让我们客观地识别共享空间或交互特征的蛋白质。”

除了引入一个集成的高通量细胞生物学实验管道，科学家们还推出了OpenCell，一个蛋白质定位和相互作用测量的开源集合。收集的数据包括当前研究的测量数据，可以通过opencell.czbiohub.org网站上的交互式网络界面轻松访问。

科学家们还描述了他们如何进行图像分析。他们将无监督聚类和机器学习结合起来，以洞察单个蛋白质的功能，并推导出人类细胞组织的一些一般原则。

“特别是，我们发现，结合RNA的蛋白质形成了一个由特定定位和相互作用特征定义的独立亚群，”科学家们指出。“我们还表明，特定蛋白质的精确空间分布与它的细胞功能密切相关，这样就可以从分析成像数据中获得细颗粒分子的见解。”

OpenCell库的方法论。(A)使用split-mNeonGreen2进行功能标记。(B)内源性标签策略。(C)实验管道。(D)荧光检测。(E)数据分析。[CZ Biohub, bioRxiv, CC-BY-NC-ND 4.0]

科学家们承认使用内源性荧光标记有一定的局限性。例如，这些标签大约和人类平均蛋白质一样大，所以它们的插入可以改变目标蛋白质的表达、定位、功能或降解速率。此外，标记可能不允许蛋白质的异构体(包括翻译后修饰的变异)被区分。最后，内源性标签可能会遗漏低丰度蛋白质。

“总的来说，”科学家们说，“完整地描述人类细胞结构仍然是一个艰巨的挑战，需要同时应用补充的方法。”剑桥大学的科学家在《分子与细胞蛋白质组学》上发表的一篇综述(“亚细胞转录组学与蛋白质组学:一篇比较方法综述”)中也提出了类似的观点（Subcellular Transcriptomics and Proteomics: A Comparative Methods Review）。

“有几个选项可供研究人员解决有关蛋白质和转录本亚细胞定位和转运的生物学问题，”审稿人指出。“然而，技术挑战仍然巨大，转录组学和蛋白质组学之间存在差异，以及生物系统和问题，这是缺乏一种通用方法的内在原因。”

尽管如此，审稿人也发出了乐观的声音:“组学与本地化研究的耦合仍在很大程度上处于起步阶段，但由于样品制备策略和设备的进步，随着单分子跟踪、测序和当前的MS技术，达到了一个顶峰，因此正迅速发展。”亚细胞组学技术不仅帮助我们洞察全球空间组织(如HPA细胞图谱)、生物学过程(如细胞周期和胚胎发育)和病理(如癌症生物学)，而且还在患者诊断应用中出现。”

CZ Biohub团队有信心，他们的方法可以识别“复杂但具有确定性的光镜图像信号”，为“深度表型和功能基因组学开辟了令人兴奋的途径”。该团队补充说，由于光学显微镜易于扩展，可以实时进行，并能在单细胞水平上进行测量，该方法应该“为全面定量描述正常生理和疾病中的细胞多样性提供了丰富的机会”。

以下是Leonetti博士的简短问答:

CZ Biohub是否正在努力将已识别的蛋白质数量扩大到目前文章中引用的1300种以上?

是的。例如，到目前为止OpenCell覆盖了整个蛋白质组的7%。我们正在使用机器人和软件改造和自动化我们的实验管道，以增加我们的产量。我们的目标是显著扩大蛋白质组的覆盖范围。一种令人兴奋的方法是探测不同细胞类型的蛋白质(并非所有的蛋白质都在所有细胞中表达)。我们可以先在干细胞中建立标记库，然后将干细胞分化成不同的细胞类型。

与其他空间生物学方法相比，CZ Biohub的方法有什么优势/劣势?它如何补充其他方法?

我们的显微镜方法的一个重要优势是，我们可以描绘活的细胞。这将是解开细胞动力学之谜的关键。一个缺点是，由于我们依赖于内源性表达，拷贝数较低的蛋白很难被检测到(我们可以通过设计更明亮的荧光探针来解决这个问题)。另一个缺点是，由于我们修改基因，从同一基因表达的所有蛋白质异构体不容易区分。例如，翻译后修饰的蛋白质不能被跟踪。免疫荧光是一个很好的辅助工具。

我们的图像分析工作表明，仅从蛋白质定位的图像中就可以提取大量的特定的、细粒度的信息。在转录组学中我们通常提取的信息中有多少可以直接从图像中提取(细胞类型、细胞状态等)，这一领域有很多人对此感兴趣。虽然还处于早期阶段，但已经有文献表明答案将是:实际上有相当多的信息!

除了空间维度，CZ Biohub的方法是否也包括时间维度?

当然，这是我们当前的重点。高通量光片显微镜的开发(Biohub社区在这方面非常活跃，例如PMID 31061492)将非常有利于这一努力。

 OpenCell: Endogenous tagging for the cartography of human cellular organization