简介 大脑皮层的正常运作需要神经回路的精细组装，这些神经回路包括兴奋性锥体神经元（PNs）和抑制性中间神经元（INs）。 大脑皮层回路发育的一个显著特征是依赖于早期的产后经验和感官刺激以及环境/社会事件( 1– 4)不同类型的皮层下投射神经元通过长程轴突将经验信息传递到皮层，并在介导经验依赖的皮层回路装配中起着中心作用。 例如，人们普遍认为谷氨酸能感觉丘脑的输入对从细胞到网络水平的一系列皮质布线事件具有关键性影响，例如神经原发生、脊柱发育、突触形成、树突重组以及功能性/解剖性神经组件的形成( 5– 9)尽管它们的作用机制不如丘脑输入所了解，但主要的神经调节系统，包括去甲肾上腺素能、5-羟色胺能、多巴胺能和胆碱能神经元，也被认为能远程影响皮层PN形态发生的几个方面，如树突和脊柱的发育( 10– 13)然而，对于大脑皮层的神经调节性输入是否以及如何调节抑制性蛋白的连接，这些抑制性蛋白在正常的大脑功能和大脑疾病的发病机制中起着关键作用，目前还知之甚少。
皮质INs局部支配周围神经元，并在突触、细胞和网络水平上形成神经元活动( 14, 15)它们的不同亚型在形态、生理和连通性上不同，它们共同完成这些复杂的任务，同时各自发挥着独特的抑制作用( 14, 15).轴突内输出的连线发生在出生后的第一个月( 16– 19)不管细胞类型如何，INs通常表现出高度分枝的轴突，被认为有利于有效地与突触后神经元建立局部、密集的连接( 20, 21)尽管是建立抑制网络的必要步骤，但在发育过程中轴突树状化的机制仍然是未知的。
包括动作电位（APs）和阈下去极化的神经元活动不仅是普通的计算信号，而且是协调神经系统发育和功能的指导/调节信号( 1, 22)研究表明，几种神经元的轴突分支( 17, 23– 30)经历细胞自主和非细胞自主活动的依赖性规则。 谷氨酸能神经元通常提供主要的兴奋性神经递质。 然而，基底前脑（BF）的胆碱能轴突通过离子型烟碱乙酰胆碱（ACh）受体（nAChRs）直接诱导皮层神经元兴奋性离子电流( 31)BF神经元早在出生后第一周就向大脑皮质投射大量胆碱能传入纤维，并持续增加至出生后2个月( 10, 32)许多跨皮质层的胰岛素以不同的亚单位组成表达nAChRs( 33)在成人大脑皮层，胆碱能传递激活了几种类型的胰岛素，这些胰岛素能激活其他胰岛素，导致PNs去抑制，从而触发可塑性和学习( 34– 36)此外，在成人海马中也存在胆碱能传入纤维，轴突终末的nAChRs可调节体周INs的突触释放，提示其在轴突中的局部功能( 37)值得注意的是，nAChR介导的ACh信号可以影响轴突的发育：一项使用无脊椎动物神经元的体外研究表明，ACh通过nAChRs调节生长锥顶端丝状体的伸长( 38)因此，胆碱能系统可能很适合研究神经调节在轴突树状化中的潜在作用。
理解布线原理的一个主要障碍是IN子类型的复杂性。 基因靶向的一个真正的亚型表现出一致的形态特征是克服这一限制的关键。 枝形吊灯细胞（ChC）是最明显的皮层亚型之一：ChC特异性地支配PNs的轴突起始段（ais），从而有力地控制其棘波的产生( 39– 43)与它们在正常大脑中的重要作用一致，ChCs与精神分裂症和癫痫等脑疾病有关( 44, 45)在内侧前额叶皮质（mPFC）、前运动皮质和扣带回皮层的浅层，CHC位于第2/3层（L2/3）的上缘，并以定型的形态建立了主要局限于上部L2/3（uL2/3）的轴突乔木( 43, 46)轴突和突触组织的均匀性是定量分析的理想条件。 因此，我们已经开发出可靠的针对发展中的CHC的基因策略。
在这里，我们在细胞和分子水平上研究了BF胆碱能轴突释放的ACh对ChC轴突树状化的作用。 我们证明轴突丝状体是活体动物ChC轴突分支的前体。 我们发现nAChR-T型电压依赖性钙（Ca 二+ )通道（VDCC）信号轴调控丝状体的起始和基底Ca 二+ 静脉曲张的水平范围是丝状孢子产生的地方。 这种调节独立于AP的产生，提示ACh信号对轴突的直接和局部作用。 我们进一步证明，nAChRs和T型VDCCs是ChC轴突乔木在体内正常发育所必需的。 最后，我们证明BF胆碱能神经元根据其活动水平双向控制ChC轴突树状化的程度。 我们的结果确立了皮层下胆碱能神经元在ChC轴突树状化中的作用，以及在出生后皮层网络组装过程中潜在的信号机制。
结果 丝状虫是体内ChC轴突乔木的前体 轴突轴丝足的延伸被认为是轴突分化的第一步( 47– 51)为了证实发展中的ChCs使用丝状延伸来形成轴突，我们在前运动皮质进行了ChCs的活体双光子成像( 图1，A和B，以及图S1）。 在胚胎15天（E15）腹内侧节隆起（MGE）前体细胞进行体外电穿孔，以检测丝状虫 Z绿色 质粒，然后移植到出生后第1天（P1）宿主幼崽的皮质( 图1A)。与我们之前的工作一致( 52, 53)在形态学上，在第1和第2代胚胎之间发育出可识别的原始神经元。 我们最近的研究表明，这些移植的ChC表达ChC标记物，并在AIS上建立正常的突触，在电生理/超微结构上与内源性ChC无法区分( 53)为了进一步验证移植CHC的特性，我们研究了内源性CHC的其他特性。 与内源性CHC相似，一小部分移植的CHC在mPFC中显示可检测到的小白蛋白（PV）信号（16.7%， n =4个大脑）。 此外，电生理记录表明，它们表现出非接触性放电特性，其放电速率与内源性发展中的ChCs和PV+INs中的相似（图S2和S6）( 18, 19, 54)此后，我们认为移植ChCs的年龄比宿主动物小5天[相当于内源性ChCs的出生后一天（EP）]。 在1小时内每隔10分钟对EP13 ChCs进行成像，显示轴索上出现丝状虫( 图1C)这些丝状体通常起源于轴突静脉曲张，提示在轴突上有丝状体起始的特殊部位。 尽管有运动性，但仍有一半以上停留在同一位置，并在随后的8小时内转变为含静脉曲张的分支（61.9±5.7%）， n =56个丝状体，来自5个细胞； 图1D)相反，96±2%的新生枝起源于丝状足( n =5个细胞的53个分支）。 这些观察表明，在轴索静脉曲张处形成丝状体是发展CHC轴突树状化的先决条件。
图1 丝状体在发育CHC过程中转化为轴突分支。
( A )实验时间表。 用电穿孔法将E15胚胎MGEs电穿孔 pCBh ZS绿色 质粒。 分离MGE组织，移植到P1寄主幼崽体内。 在P18（EP13）处安装颅窗，随后进行双光子显微镜检查。 ( B )活体双光子显微镜成像的皮质ChC俯视图。 在体内成像后，对细胞进行事后分析，以确定它们是ChCs（图S1）。 ( C )每10分钟拍摄一次ChC轴突的体内延时图像，持续1小时，随后8小时后。 注意一个动态丝状体（充满箭头），从轴索静脉曲张（箭头）出现，并最终在8小时后转变为一个分支。 开放的箭头显示没有丝状体。 ( D )动态丝状孢子在8小时后转变为分枝的百分比的量化( n =5个小鼠的5个细胞）。 数据以平均值±扫描电镜表示。 FP，丝洛波迪亚。 比例尺，5μm（C）和20μm（B）。
α4-nAChRs通过激活T型VDCCs调节ChC轴突丝状体的起始 在几种类型的神经元中，神经元活动与轴突分支有关( 17, 23– 30)为了探索在ChC轴突发育过程中，什么样的活动可以调节丝虫病的发生，我们建立了一个体外实验系统，允许我们进行一系列的药理学实验。 在含有EP12 ZsGreen标记的ChCs的急性脑切片中，双光子成像显示了轴突静脉曲张处的丝虫病起始事件，这表明在体外成功地再现了轴突分支的细胞机制( 图2，A和B，图S3和电影S1）。
图2 nAChRs通过T型VDCCs调节轴突丝状体的形成。
( A )实验示意图。 在mPFC急性切片中，每隔10min对移植ZsGreen标记的ChCs的轴突结构进行成像，连续3个周期，包括“基线”、“暴露”和“冲洗”，每1小时。 影像学检查局限于近端轴突区。 在每个时间点计算新出现的丝状体（小插图中的箭头）。 ( B )一系列时间推移图像测试了美沙明（nAChR拮抗剂）对ChC轴突丝虫病发生的影响：第一小时：基线； 第2小时：药物接触； 第三小时：洗脸。 箭头：启动丝足纲。 比例尺，5μm( C 到 E )药理学测试乙酰胆碱酯酶信号在丝虫病发生中的作用。 （C） 阿托品（mAChR拮抗剂）[左：重复测量（RM）单向方差分析， P =0.857， F =2.999，df=8， n =3]和美沙明（右：RM单向方差分析*** P <0.001， F =44.12，df=14， n =5）。 （D） DHβE（α4-nAChR拮抗剂）（左：RM单因素方差分析*** P <0.001， F =170.2，df=14， n =5）和MLA（α7-nAChR拮抗剂）（右：RM单向方差分析， P =0.316， F =1.6，df=8， n =3）。 ( E )尼古丁（nAChR激动剂）（RM单因素方差分析** P =0.0011， F =29.8，df=14， n =5）。 ( F )光生辅助刺激BF轴突对丝虫病发生的影响。 操作示意图。 将含有mChrimson和ZsGreen标记的MGE祖细胞的Cre依赖性aav注入P1 聊天室 小狗（左）。 光诱导丝状孢子起始（右：RM单向方差分析* P =0.0119， F =10.13，df=8， n =3）。 ( G )WT-ChCs和α中丝虫病的起始事件 4-氯化钠 惠特曼（Chko，左）纯合子检验** P =0.008， n =5）以及尼古丁暴露于α 4-氯化钠 纯合子KO-ChCs对丝状虫起始的影响（右：Wilcoxon试验， P =0.875， n =5）。 ( H )外部Ca的作用 二+ 在丝状孢子起始阶段（RM单向方差分析*** P <0.001， F =37.2，df=14， n =5）。 ( 我 )药理学研究T型VDCCs在丝状孢子虫发生中的作用及其与nAChR信号的关系。 米贝拉地尔（T型VDCC拮抗剂）（左：RM单向方差分析** P =0.0025， F =36.6，df=14， n =5）。 尼古丁+米贝拉地尔（右：RM单向方差分析** P =0.0054， F =20.1，df=14， n =5）。
利用这个实验系统，我们首先确定河豚毒素（TTX）阻断APs是否会影响丝虫的启动。 大量Ca 二+ 在细胞体中观察到瞬变，如预期的那样，TTX在我们的急性切片样本中显著降低了它们（图S4）。 我们测量了三个连续时间段（包括“基线”、“药物暴露”和“冲洗”）中丝虫起始事件的数量，每个时间段为1小时，并且发现TTX不会导致丝虫起始的显著变化（图S5，左图）。 这些结果表明，丝状虫的启动并不需要一般的突触传递到ChCs和/或ChCs中的神经元尖峰。
先前的研究表明，γ-氨基丁酸（GABA）能传递在P12和P18之间具有兴奋性( 19)，对应于我们实验的时间窗。 为了验证在AIS上GABA能兴奋逆行影响ChCs丝状孢子起始的可能性，我们应用了GABA A型（GABA A )受体阻滞剂加巴嗪对急性切片。 在加巴嗪给药前后，丝状虫起始事件的数量保持不变（图S5，右图），表明GABA A ais的受体介导的信号转导不参与丝虫病的发生机制。
乙酰胆碱能轴突释放的乙酰胆碱能通过nAChRs直接诱导兴奋性离子电流( 31)先前的一项使用池蜗牛神经元的体外研究表明，nAChR介导的信号刺激生长锥丝足的伸长( 38)因此，我们假设通过nAChRs的ACh信号通过控制丝状体的启动来调节ChCs的轴突树状化。 为了探索这一可能性，我们研究了激活nAChRs是否对丝虫病的发生是必要的。 作为发展中的ChCs已知同时表达nAChRs和毒蕈碱型（代谢型）AChRs（mAChRs）( 55)，我们还测试了拮抗剂对mAChRs的影响。 而对mAChRs的拮抗剂没有效果( 图2C抗nAChRs的一般事件明显减少( 图2C，对）。 这种由nAChR拮抗剂引起的丝状孢子起始的下调在冲洗后被逆转，表明这种作用不是由于药物毒性引起的( 图2、B和C，对）。 nAChR阻滞剂对ChCs的峰值特性没有显著影响，证实其对丝状孢子起始的作用不是通过ChCs固有特性的改变来介导的（图S6）。
nAChRs由不同的亚型组成，其中包含5个亚基，具有不同的亚基类和亚类组合( 31)大脑中有两种主要的亚型：α4亚单位-含nAChRs（α4-nAChRs）和α7亚单位-含nAChRs（α7-nAChRs）( 31)为了解决哪一个亚型对丝虫病的发生是必要的，我们检查了特定的拮抗剂对每种亚型的影响。 α4-nAChR拮抗剂（而非α7-nAChR拮抗剂）可显著降低丝虫病的发生( 图2D)这种阻断作用的程度与一般的nAChR拮抗剂相似，提示丝状孢子起始所必需的ACh信号主要是通过α4-nAChRs介导的。 接下来，我们想知道增强nAChR介导的信号是否会增加ChCs中丝虫病的起始事件。 为了验证这一观点，我们研究了nAChR激动剂尼古丁对丝虫病发生的影响。 尼古丁可显著增加丝状孢子虫的发生率( 图2E)当光刺激表达兴奋性视蛋白mChrimson的BF胆碱能神经元的轴突时，也观察到了类似的作用，表明BF胆碱能轴突释放的ACh具有立即促进丝状虫发生的活性( 图2F)以上药理实验的结果通过检测α-ChCs的移植得到进一步验证 4-氯化钠 种系敲除小鼠( 56)在单细胞水平。 α4-nAChR-KO-ChCs的丝状孢子起始事件数明显低于对照野生型（WT）ChCs( 图2G，左）。 尼古丁在α4-nAChRs-KO-ChCs中对丝虫病的发生没有影响，而在WT-ChCs中尼古丁对丝虫病的发生没有促进作用( 图2，E和G，对）。 这些结果有力地证明了nAChRs对ChC丝状孢子虫的特异性和细胞自主性要求。 总之，通过nAChRs（主要是α4-nAChRs）介导的ACh信号在促进丝虫病发生中起着关键作用。
接下来，我们试图确定nAChR激活下游的分子机制，该机制有望诱导膜去极化。 成年海马篮子细胞轴突终末的nAChR激活通过一种需要T型VDCCs的机制导致GABA释放( 37)我们推断，在制造ChC轴突的过程中，类似的机制可能控制丝虫病的发生。 与这个假设一致，细胞外钙的消耗 二+ 可逆减少丝状孢子起始( 图2H)Ca，暗示 二+ 来自细胞外环境的内流是丝状虫发生的必要条件。 为了确定VDCCs在丝状孢子虫发生中的作用，我们测试了拮抗剂对不同类型VDCCs的作用。 针对高vdcc的阻断剂（N-、L-、P/Q-和R-型）没有效果（图S7A）。 然而，那些对抗T型低VDCCs的人却显著降低了丝虫病的发生( 图2I，左）。 如果T型VDCC作用于nAChRs下游，则尼古丁对丝虫病发生的促进作用会被T型VDCC阻滞剂的共同存在所抵消。 我们发现，T型VDCC阻滞剂显著抵消了尼古丁的促进作用( 图2I，对）。 这种阻断效应不是通过ChC固有特性的改变来介导的，因为它们的峰值特性没有被阻断剂改变（图S6）。 这些结果表明，T型VDCCs作用于nAChR活化的下游，介导了丝状孢子在ChCs发育过程中的启动。
此外，为了深入了解nAChRs在丝状虫发生中的作用的细胞类型特异性，我们检查了nAChR阻断剂是否减少了由移植的MGE祖细胞偶尔产生的假定篮子细胞中的丝虫病起始事件。 将表达PV但无明显突触盒的假定篮子细胞暴露于nAChR阻滞剂后，其丝状孢子起始无明显变化（图S8）。 因此，至少在一定程度上，nAChR对丝状孢子的启动具有细胞类型特异性。
α4-nAChR-T型VDCC信号轴决定了ChC轴索静脉曲张的基础钙水平范围 如前所述，丝状孢子首先发生在轴索静脉曲张处。 这项观察提出了T型vdcc存在于轴突静脉曲张中以介导局部Ca的可能性 二+ 丝足菌发生所必需的内流。 为了验证这一观点，我们首先研究了T型VDCC亚型-Cav3的定位。 1，腔3。 2和Cav3。 免疫组织化学法检测内源性ChCs中的3-in。 我们找到了Cav3。 2和Cav3。 3例局限于轴索静脉曲张，而Cav3。 1在ChC轴突中几乎不存在（图S7B）。 这些发现促使我们进行药理学实验来测试T型vdcc是否指示细胞内Ca 二+ 轴索静脉曲张的水平。 我们共同提出了Ca 二+ 如前所示，在P12内源性ChCs中使用红色荧光蛋白（RFP）标记的指示剂（Fluo-5F）和红色荧光染料（Alexa fluor594）( 46)并在给药前、后各时间段每隔30s同步成像一次，持续30min( 图3A)我们的分析集中在静脉曲张上，这些静脉曲张在给药前表现出丝虫病( 图3，A和B)我们发现 二+ 这些静脉曲张的水平下降后，给予T型VDCC阻滞剂( 图3、C和D)提示T型vdcc有助于维持基底Ca 二+ 电平范围。 虽然平均 二+ 钙水平降低了 二+ 在存在T型VDCCs阻滞剂的情况下，水平继续波动，增加事件的频率和幅度类似于在没有阻断剂的情况下观察到的事件（图S9）。 这些结果表明T型vdcc是维持基底Ca的必要条件 二+ 电平范围，但不适用于Ca 二+ ChC轴索静脉曲张的水平波动。 接下来，我们研究了nAChR-T型VDCC信号是否有助于基础Ca的形成 二+ 轴突静脉曲张的水平范围。 与T型VDCC阻滞剂类似，nAChR拮抗剂降低了平均Ca 二+ 电平，而Ca的频率和振幅 二+ 静脉曲张程度的增加没有改变( 图3E以及图S9）。 相反，服用尼古丁会迅速增加平均钙含量 二+ 水平( 图3F)与T型VDCC作用于nAChRs下游的观点一致，尼古丁的这种作用完全被T型VDCC阻滞剂所阻断( 图3G)上述发现表明，丝虫病的发生与TTX的存在有关，表明丝虫病发生的信号机制与AP的产生无关。 因此，TTX不影响平均Ca 二+ 以及尼古丁引起的轴突静脉曲张的增加( 图3，H和I)这些结果表明，nAChRs的激活控制着基底Ca 二+ ChC轴突树状化过程中T型VDCC静脉曲张的水平范围。 这种调节可能在轴突中局部发挥作用，而不依赖于对ChCs的一般突触传递和/或ChCs中的神经元尖峰。
图3 nAChRs调节基底Ca 二+ T型VDCCs在ChC轴索静脉曲张中的水平范围。
( A )实验示意图。 用Fluo-5F和Alexa-fluor594电穿孔法对单个内源性ChCs进行电穿孔，在给药前和给药后各时间段每隔30min成像一次。 Alexa Fluor 594被用来清晰地显示丝状虫，因为RFP信号强度不足以成像。 成像/分析仅限于近端轴突（蓝色正方形）。 加利福尼亚州 二+ 在给药前和给药后测量静脉曲张的水平，这些静脉曲张在给药前已经显示出丝虫病（黑色箭头）。 静脉曲张显示没有丝虫病不包括在分析（蓝色箭头）。 ( B )轴突结构（Alexa-fluor594）和Ca的同步成像 二+ 在p15NaCl和P15HR信号应用于CH2之前。 从轴索静脉曲张（虚线）开始的丝状体（箭头）显示在给药前。 比例尺，5μm( C 到 我 )药理学实验验证nAChR-T型VDCC通路在调节基底Ca中的作用 二+ 静脉曲张的水平范围。 细胞内钙离子的时间进程 二+ 在每一个原始（顶部）中，每一个bouton中的水平都用颜色编码的热图表示。 下图显示平均Ca 二+ 给药前后的水平。 （C） 对照溶液[Wilcoxon检验（双尾）， P =0.563， n =34]。 （D） Mibefradil[Wilcoxon（双尾）试验*** P <0.001， n =31]。 （E） 美沙明[威尔科克森试验（双尾）、*** P <0.001， n =32]。 （F） 尼古丁[Wilcoxon（双尾）试验*** P <0.001， n =30]。 （G） 尼古丁+米比拉地尔[威尔科克森（双尾）试验*** P <0.001， n =27]。 （H） TTX[Wilcoxon（双尾）检验， P =0.7078， n =26]。 （一） TTX+尼古丁[Wilcoxon（双尾）试验*** P <0.001， n =27]。 n 表示四个急性切片中四个细胞的静脉曲张数。
探讨Ca的潜在作用 二+ 在丝状孢子起始阶段的水平波动，我们进一步检验了Ca与 二+ 轴索静脉曲张处的水平升高和丝虫病的发生。 需要注意的是，由于固有的技术限制（见材料和方法），我们成像的时间分辨率是有限的，因此，我们不打算带来快速的Ca 二+ Ca等事件 二+ 有人质疑。 然而，我们发现丝状孢子虫的发生与先前的Ca有关联 二+ 电平增加（图S10，A和B）。 我们在使用表达轴突靶向GCaMP6s的EP12移植ChCs（Axo-GCaMP6s）和单体DsRed（图S10，C和D）的替代实验中获得了类似的结果。 根据成像间隔，我们估计 二+ 水平升高可能发生在丝状孢子开始前1分钟内。 因此，约 二+ 水平的增加可能在丝状体的形成中起重要作用。 但是，因为 二+ 水平的增加不一定伴随丝虫病的发生，它可能不足以诱导丝虫病。 通过nAChRs和T型vdcc的ACh信令可以设置适当的Ca 二+ Ca的电平范围 二+ 水平的增加达到允许丝状虫发生的条件。
α4-nAChRs和T型VDCCs在体内控制ChCs轴突树状化 为了确定nAChR-T型VDCC信号轴是否是体内ChCs轴突树状化所必需的，我们进行了功能丧失（LOF）实验。 我们首先检测了由CRISPR-Cas9方法产生的移植α4-nAChR突变体ChCs。 CRISPR-Cas9转染的ChCs的基因型通过事后单细胞基因分型确定（图S11）( 57)与WT对照组相比，EP13杂合子α4-nAChR突变体ChCs和纯合α4-nAChR突变体ChCs轴突支减少，且呈基因剂量依赖性( 图4，A至C)这些发现通过实验进一步验证，这些突变ChCs来源于MGEα祖细胞 4-氯化钠 KO小鼠( 图4，D和E) ( 56)此外，为了深入了解α4-nAChR在内源性ChCs轴突树状化中的作用，我们在杂合子KO小鼠中检测了基因标记的内源性ChCs( 图4F)根据移植杂合子α4-nAChR突变体ChCs的结果，P13杂合子α中的内源性ChCs 4-氯化钠 KO小鼠的轴突分支点数量明显少于WT小鼠( 图4，G和H)因此，这些发现提示α4-nAChRs是ChCs轴突树状化所必需的。 我们的结果也表明ChC轴突树状化对α敏感 4-氯化钠 基因剂量。
图4 .ChC轴突树状化需要α 4-氯化钠 剂量敏感的基因。
( A )实验示意图。 分析盒状区（黑色正方形）的近端轴突。 重建红色矩形内的轴突。 ( B )EP13移植的ZsGreen标记的转染ChCs的共聚焦图像 拉斯格纳兹 （左）或α 4-nAChR-sgRNAs （中间和右侧）。 这些细胞的合子性是通过事后单细胞基因分型来确定的。 ( C )中的分支点数 LacZ-sgRNA转染的ChCs( n =5个来自三只老鼠的细胞）和 α 4-nAChR-sgRNA –转染ChCs（het: n =3只小鼠的6个细胞； 人类： n =三只老鼠的6个细胞）。 单因素方差分析* P <0.05** P <0.01，以及*** P <0.001， F =30.32，df=16。 ( D )EP13移植GFP标记的WT小鼠ChCs与α的共聚焦成像 4-氯化钠 纯合KO小鼠。 ( E )来源于WT小鼠的GFP标记ChCs的分支点数目( n =5个来自三只老鼠的细胞），α 4-氯化钠 杂合子KO小鼠和α 4-氯化钠 纯合KO小鼠（het: n =3只小鼠的5个细胞； 人类： n =5个来自三只老鼠的细胞）。 单因素方差分析*** P <0.001， F =39.48，df=14。 ( F )示意图显示标记内源性CHC的遗传策略。 ( G )P13内源性RFP标记的WT小鼠ChCs（左）和α的共聚焦图像 4-氯化钠 杂合子KO小鼠（右）。 ( H )WT小鼠内源性ChCs的分支点数( n =10个来自三只老鼠的细胞）和α 4-氯化钠 杂合子小鼠( n =5个来自三只老鼠的细胞）。 t 双尾试验* P =0.0272， t =2.49，df=13。 在（B）和（D）中，单个光学切片显示了与AnkG标记的ais相连的突触盒。 带箭头的白色框中的区域被放大并覆盖了AnkG频道。 底部的面板显示在( A ).比例尺，10μm。
接下来我们检查移植的Cav3。 2个纯合突变ChCs和移植的Cav3。 3个纯合突变ChCs是由基于CRISPR-Cas9的方法产生的。 因为这些蛋白的良好抗体是可用的，我们用免疫组织化学方法鉴定了纯合突变型ChCs（图S12）。 EP13纯合Cav3轴突支点数。 与对照组相比，突变体ChCs显著减少，而纯合子Cav3显著降低。 2株突变型ChCs无表型( 图5，A和C，以及图S13）。 我们通过检测移植的Cav3进一步证实了这些发现。 3株来自纯合子系KO小鼠的突变型ChCs( 58)移植Cav3。 与对照组相比，来自杂合子KO小鼠的突变体ChCs也显示出分支点数量的显著减少，尽管这种表型比来自纯合KO小鼠的移植ChCs的表型温和( 图5、B和C)此外，我们还测试了降低Cav3的效果。 3基因剂量对杂合子KO小鼠内源性ChCs轴突分支的影响。 P13杂合子KO小鼠ChC轴突的分支点数目明显少于WT小鼠( 图5，D和E)这些结果表明，轴突树状化在发展CHC时需要 第三章。 3-T型VDCC 剂量敏感的基因。 因此，nAChR-T型VDCC信号轴在体内建立ChCs高度分支的轴突中起着至关重要的作用。
图5 .ChC轴突树状化需要 第三章。 3-T型VDCC 以敏感的剂量。
( A 和 B )EP13移植的ZsGreen标记的转染ChCs的共聚焦图像 LacZ sgRNAs公司 （A，左）或 第三章。 3个sgRNAs （A，右）以及EP13移植的绿色荧光蛋白标记的ChCs来源于 第三章。 三 种系KO小鼠（B）。 中间的面板显示了单个光学切片，显示了与AnkG标记的ais相连的突触盒。 带箭头的白色框中的区域被放大并覆盖了AnkG频道。 底部的面板显示在 图4A. ( C )中的分支点数 LacZ sgRNA –转染ChCs( n =5个来自三只老鼠的细胞）， 第三章。 3 sgRNA- 转染纯合KO-ChCs( n =5个来自三只小鼠的细胞），移植的CHC来源于 第三章。 三 纯合子KO小鼠( n =6个来自三只小鼠的细胞），并且移植的CHC来源于 第三章。 三 杂合子KO小鼠( n =5个来自三只老鼠的细胞）。 单因素方差分析* P <0.05*** P <0.001， F =14.3，df=20。 ( D )野生型小鼠P13内源性RFP标记的ChCs的共聚焦图像（左）和 第三章。 三 杂合子KO小鼠（右）。 ( E )WT小鼠内源性ChCs的分支点数( n =5个来自三只老鼠的细胞）和 第三章。 三 杂合子KO小鼠( n =三只老鼠的6个细胞）。 t 试验（双尾）** P <0.01， t =5.80，df=9。 比例尺，10μm。
活体树状胆碱能神经元轴突胆碱能活性的调节 我们的体外研究发现，急性刺激BF胆碱能神经元轴突终末促进ChC轴突中丝状体的形成，这一发现为BF神经元在体内控制ChC轴突树状化程度中发挥关键作用提供了可能性。 为了验证这个观点，我们首先通过注射含有抑制性恐惧的Cre依赖性腺相关病毒（aav）来减少BF胆碱能轴突的突触传递( AAV信用证 )P1-胆碱乙酰转移酶（ChAT）-Cre小鼠BF的研究( 图6A) ( 59)用这种方法，我们能够针对大部分表达ChAT的BF神经元（81±3%，866个ChAT）为靶点 + 细胞，七种动物）( 图6A)通过将绿色荧光蛋白（GFP）电穿孔ChC前体细胞移植到大脑皮质，观察ChC 聊天室 病毒注射期间的小鼠。 我们给了氯氮平 N -氧化物（CNO），激活INDRADD或生理盐水 聊天室 老鼠每天一次，持续一周，然后在第18天献祭。 我们发现，与对照组相比，抑制BF神经元的活动可以显著减少EP13 ChCs轴突分支点的数量( 图6、B和C)在不表达inDREADD的动物中，CNO对ChC轴突树状化没有影响( 图6，D和E)当我们使用破伤风毒素轻链阻断BF胆碱能神经元的神经传递时，我们得到了类似的结果（图S14）。 然后我们用兴奋性恐惧（exfredd）测试了增强BF神经元的活性是否足以促进ChC轴突树状化。 与对照组相比，CNO治疗组动物的EP13-ChCs轴突分支点数量显著增加( 图6，F至H)这些结果表明，BF胆碱能神经元长程轴突释放适量的乙酰胆碱，对ChCs在出生后发育过程中轴突的正常树状化至关重要。
图6 适当水平的BF胆碱能神经元活动是ChCs轴突树状化的必要条件。
( A )inDREADD在BF聊天中的具体表达 + 神经元 聊天室 小鼠注射 AAV信用证 。右，小面板表示ChAT（绿色）和inDREADD（红色）在左面板的框内区域内的同域化。 ( B )EP13将表达inDREADD的小鼠移植到用生理盐水（左）或CNO（右）处理的BF中的GFP标记的ChCs。 ( C )表达inDREADD的盐水处理小鼠分支点的定量研究( n =5个来自三只小鼠的细胞）和CNO处理的小鼠表达INDRADD( n =6只小鼠的细胞）。 t 试验（双尾）** P <0.01， t =4.26，df=10。 ( D )EP13移植GFP标记ChCs的共聚焦图像研究 聊天室 用生理盐水（左）或CNO（右）治疗的小鼠。 ( E )EP13-GFP标记ChCs支点的定量研究 聊天室 用生理盐水或CNO处理的小鼠。 t 测试， P =0.7097， t =0.386，df=8， n =每只小鼠取5个细胞。 ( F )注入 AAV信用证 进入的BF 聊天室 小鼠在ChAT中特异表达exfread + 神经元。 面板显示BF区域的ChAT（绿色）和Exbreadd（红色）的共域化。 ( G )EP13将GFP标记的ChCs移植到用生理盐水（左）或CNO（右）处理的表达Exdread的小鼠体内。 ( H )表达Extreadd的盐水处理小鼠分支点的定量研究( n =5个来自三只老鼠的细胞）和CNO处理的小鼠表达( n =5个来自三只老鼠的细胞）。 t 试验（双尾）** P <0.01， t =4.26，df=8。 所有数据均以平均值±扫描电镜表示。 在（B），（D）和（G）中，单个光学切片显示了与AnkG标记的ais相连的突触盒。 带箭头的白色框中的区域被放大并覆盖了AnkG频道。 底部的面板显示在 图4A.比例尺，10μm（B，D，G），200μm[右小面板在（A）和（F）]，500μm[左面板在（A）]。
讨论 尽管一项测试BF胆碱能神经元在皮质发育中作用的损伤研究显示PNs中存在广泛的结构缺陷，包括未成熟的树突生长、较少的棘突、较小的躯体和异常的连接( 60– 62)由于结构的永久性消除，BF轴突终末的ACh神经传递是否以及如何调节这些结构的形成仍然是个未知数。 此外，胆碱能系统在神经回路发育中的作用仍然是完全未知的。 我们的结果表明，BF神经元的活性水平决定了ChCs的轴突树状化水平，而BF神经元的活性水平决定了ChCs的双向释放程度。 此外，我们还提供了体内证据，证明nAChR-T型VDCC通路细胞能自主形成ChC轴突树状化。 我们的结果表明，这个信号轴调节丝状体的启动，这是使ChC轴突树状化的关键事件。 我们在电路、细胞和分子水平上的全面研究确立了皮层下胆碱能神经元在接线中的作用，以及在出生后皮层网络组装过程中潜在的信号机制。
我们的体内影像学研究显示，丝状足是树枝的前兆结构。 我们还证明了nAChR–T型VDCC信号对于丝状虫的发生和轴突树状化的适当水平是必要的。 这些发现与控制轴索形成的程度一致。 然而，值得注意的是，其他事件，如丝足/分支的维持也有助于确定轴突分支的水平。 我们并不否认nAChR-T型VDCC信号可能在除丝状孢子起始外的其他方面发挥作用的可能性。
因为BF胆碱能轴突和ACh受体广泛分布于发育中的出生后皮质( 10, 31, 32)，关于ACh如何影响ChC轴突树状化的一个可能的解释是ACh通过控制周围输入神经元的活动间接地、非细胞自主地影响它。 然而，从我们的一系列实验中获得的几行证据始终否定了这一观点。 首先，TTX阻断APs对丝虫病的发生没有影响。 第二，TTX不阻断尼古丁引起的Ca升高 二+ 轴索静脉曲张的水平范围。 第三，α4-nAChR-LOF或Cav3。 单个ChCs中的3lof导致轴突分支表型，尽管周围细胞是完整的。 因此，一般的突触传递到ChCs和/或ChCs中的神经元尖峰不太可能间接介导ACh对轴突树状化的影响。 鉴于BF轴突不可能与ChCs形成轴突突触，我们提出BF轴突通过容积传递释放的环境ACh直接诱导ChC轴突中的ACh信号来诱导丝虫病。 持续去极化可导致T型激活后迅速失活。 因此，尽管机制尚不清楚，但乙酰胆碱诱发的去极化必须在适当的时间窗口内终止，以恢复和重新激活T型vdcc。
我们的研究发现，ChC轴突树状化的程度取决于BF胆碱能神经元活动水平的双向改变，这表明皮层下胆碱能系统有可能在出生后早期逐步调节ChC的接线。 我们的数据显示，轴突树状化对nAChRs或T型vdcc的杂合缺失敏感，也支持这一观点。 一个有趣的可能性是，出生后早期的环境和行为状态可能会影响BF胆碱能神经元的活动水平，从而微妙地塑造ChCs轴突树状化的程度。 早期的生活经验可以通过这个机制来决定PN的峰值特性。 应该确定什么样的环境和行为条件会影响幼年出生后动物BF胆碱能神经元的活动。
胆碱能信号和ChC通路的紊乱与一些脑疾病有关，如精神分裂症、癫痫和注意缺陷多动障碍( 44, 45, 63– 66)我们发现胆碱能系统调节ChC轴突树状化提供了这两种缺陷之间的潜在联系。 目前尚不清楚胆碱能系统是否普遍影响轴突树状化。 然而，我们的研究结果提供了一种观点，即胆碱能信号的病理状态可以导致抑制回路的异常形成。 因此，我们的研究为理解由神经调节缺陷引起的脑疾病的病因提供了一个新的方向。
材料和方法 所有使用活体动物的实验程序都得到了马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所动物护理和使用委员会的批准，并按照机构和联邦指南执行。 这些老鼠被关在12小时的光/暗循环下，关在标准的笼子里，水和食物可以随意选择。 E0和P0分别以堵塞的日期和出生的日期来定义。
小鼠劳损 Nkx2。 1-CreER公司 （JAX，库存编号014552）老鼠和 LSL-RFP ( Ai14型 )（JAX，库存编号007914）小鼠来自杰克逊实验室。 三联脂蛋白（AIGFLP）在LSGFL之前已经被描述过( 52).纯合菌落 Ai14型 老鼠， Ai47型 老鼠， 聊天室 mice（JAX，库存编号06410）， 第三章。 三 KO小鼠和α 4-氯化钠 KO小鼠采用近交饲养。 Nkx2。 1-过滤器； Ai14/Ai14型 老鼠或 Nkx2。 1-过滤器； Ai47/Ai47型 最初有着混合遗传背景的老鼠[瑞士韦伯斯特（SW）和129/B6]，与其他老鼠相比 Ai14型 纯合小鼠或 Ai47型 三代以上SW背景纯合子小鼠获得SW背景小鼠。 获得 Nkx2。 1-过滤器； Ai14型/+ 老鼠和 Nkx2。 1-过滤器； Ai47型/+ 实验用的老鼠， Nkx2。 1-过滤器； Ai14/Ai14型 雄性小鼠和 Nkx2。 1-过滤器； Ai47/47型 雄性小鼠分别与SW雌性小鼠杂交。 获得 Nkx2。 1-过滤器； Ai14/+； α 4-氯化钠 击倒对手 / +老鼠和 Nkx2。 1-过滤器； Ai14/+； 第三章。 三 击倒对手 /+ 小鼠，α 4-氯化钠 纯合子KO雄性小鼠和 第三章。 三 将纯合子KO雄性小鼠分别与 Nkx2。 1-过滤器； Ai14/Ai14型 雌性老鼠。 得到α 4-氯化钠 杂合子KO小鼠和 第三章。 三 杂合子KO小鼠，α 4-氯化钠 纯合子KO雄性小鼠和 第三章。 三 分别将纯合子KO雄性小鼠与SW雌性小鼠杂交。 获得杂合子 聊天室 小鼠，纯合子 聊天室 雄性小鼠与SW雌性小鼠杂交。 获得 聊天室； Ai14型/+ 小鼠，纯合子 聊天室 雄性小鼠与纯合子杂交 Ai14型 雌性老鼠。
三苯氧胺诱导 用三苯氧胺（Tmx）在E17时灌胃给定时怀孕的雌性大鼠，以诱导其子代的CreER活性。 调整稀疏剂量，使之达到体重的15.0毫克。 Tmx溶液以2 mg/ml的工作浓度在玉米油（Sigma-Aldrich）中制备，冷藏，避光，并在1个月内使用。
sgRNA结构的生成 建造 AAV:ITR-U6-sgRNA（主干）-pCBh ZsGreen WPRE hGHpA ITR ，编码序列 Cre公司 在里面 AAV:ITR-U6-sgRNA（主干）-pCBh Cre WPRE hGHpA ITR （Addgene，质粒号60229）替换为 Z绿色 .产生质粒 LacZ sgRNA , a4nachr-sgRNA , 第三章。 2 sgRNA ，或 第三章。 3 sgRNA ，将含有基因组目标序列的退火寡核苷酸插入到 AAV:ITR-U6-sgRNA（主干）-pCBh ZsGreen WPRE hGHpA ITR 单导RNA（sgRNA）寡核苷酸序列如下：5′-tgcga-atacg-cccac-gcgat-3′( LacZ sgRNA )，5′-gatga-tgacg-accaa-cgtgt-3′（α 4-nAChR-sgRNA )，5′-tctgc-ctcgg-gcaaa-ccacg-3'( 第三章。 2 sgRNA )，和5′-gcgca ggcag aagaa ggcaa-3′( 第三章。 3 sgRNA )我们得到了 pSpCas9型 ( pX165型 )来自Addgene（Addgene，质粒号48137）。
用测量者分析法验证sgRNA结构 α的验证 4-nAChR-sgRNA 构造如前所述执行( 57)神经2a细胞转染α 4-氯化钠 sgRNA（2μg/μl）和 CBH-CASPX9型 （1μg/μl）根据制造商说明使用脂质体3000（Invitrogen）构建。 培养1周后，用100μl含蛋白酶K的直接PCR裂解试剂（细胞）（Viagen Biotech）裂解细胞（最终浓度0.1mg/ml；Ambion）。 以细胞裂解物为模板，sgRNA靶点周围的基因组区域被聚合酶链反应（PCR）扩增。 对PCR产物进行异源双链形成的再退火过程：95°C 10分钟，95°C到85°C，2°C/s，85°C到25°C，0.3°C/s，保持在25°C。重新整理后，用Surveyor核酸酶和Surveyor enhancer s（转基因）处理产物，并在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。 引物序列如下：α4-nAChR，前5′-tgag-gcac-tcct-tcct-gaag-3′； 背面5′-cagc cact gcca gag AGG tgtc-3′。
MGE的体外电穿孔、MGE移植物的移植和病毒注射 定时妊娠SW或α 4-氯化钠 纯合子KO小鼠在E15时用异氟醚深度麻醉。 宫颈脱位后，解剖子宫并保存在Krebs缓冲液（126mmnacl）中 2 ，2.5毫米氯化钾 2 1.2毫米不含 2 人事军官 4 ，1.2毫米氯化镁 2 ，2.1毫米氯化钙 2 25毫米NaHCO 三 ，以及1 mM葡萄糖）。 从胚胎头部取出脑，并将质粒溶液注入每个心室。 然后，使用钳子电极（直径5 mm；Nepa基因）进行背侧腹侧电穿孔（70 V，50 ms持续时间，950 ms间隔，5次脉冲，10%衰变；Nepa基因）。 使用了以下结构： pxCBh ZS绿色 （2μg/μl）， pCAG绿色荧光蛋白 （2μg/μl）， pU6 LacZ sgRNA （2μg/μl）， pU6-α4-nAChR-sgRNA （2μg/μl）， pU6-Cav3。 3-sgRNA （2μg/μl）， pU6-Cav3。 2-sgRNA （2μg/μl）， 6GCR轴 （2μg/μl）， pCAG提顿 （1μg/μl）， pCAG DsRed公司 （2μg/μl），以及 pxCBh-Cas9 （1μg/μl）。 之后，用组织切割器（细胞内）将大脑切成400μm的切片。 脑片保存于冬眠缓冲液（Hibernate-E，100×glutax，50×B27增补剂，Gibco）。 将腹侧MGE解剖收集于1ml冬眠缓冲液中，用200μm移植物手工切割成约200μm。
P1-SW小鼠在冰上麻醉5分钟，并确保没有疼痛感。 一个胚胎的胚胎组织在bregma前方0.2 mm和侧面0.2 mm处注射，深度为150-300-μm，使用拉拔玻璃吸管（型号：G150F-4，华纳仪器），结合立体定向仪（Kopf）和皮克斯皮策（Parker）。 切口用vet bond（Patterson Veterinary）缝合，将幼崽放在37°C的加热板上，直到完全恢复，然后返回给母亲。 同时操纵ChCs和BF神经元，500 nl AAV-CreD-hM4D-mCherry公司 （目录号44362-AAV9，Addgene）， AAV-CreD-hM3D-mCherry公司 （目录号44361-AAV9，Addgene）， AAV CreD mCrimson TD番茄 （目录号62723-AAV5，Addgene），或 AAV CreD TeTxLc HA系列 （ViGene Biosciences，MD）在移植转染的胚胎组织移植物前，在bregma前方1.5 mm处和外侧1.5 mm处，在2.5至3.0 mm深度处注射到P1宿主小鼠体内 pCAG绿色荧光蛋白 （2μg/μl）。 出生后 聊天室 给老鼠注射 AAV-CreD-hM3D-mCherry公司 或 AAV-CreD-hM4D-mCherry公司 以生理盐水或生理盐水腹腔注射CNO（5mg/kg）为对照，连续7天，每日1次。 移植MGE祖细胞的小鼠 pCAG提顿 , pTRE-Axo-GCaMP6s ，和 pCAG DsRed公司 双光子显像前腹腔注射强力霉素（2.5g/kg）生理盐水，每日1次，连续5d。
为了确定前扣带回皮质和前扣带回皮质uL2/3的移植细胞中ChCs的比例，我们对形态学鉴定的ChCs数目进行了计数，这些细胞显示了与ais相关的突触盒。 移植细胞中，ChCs占68±2%( n =120个来自三个大脑的细胞）。
体内双光子成像 在第13天，在老鼠的头上安装了一个含有CHP18图像的窗口。 在手术过程中，用异氟醚麻醉小鼠，将其头部固定在立体定向装置（Kopf）中。 去除毛发和皮肤后，用手术刀在前运动皮质上开一个直径3毫米的圆形切口。 在用人工脑脊液（aCSF）冲洗大脑皮质的同时取下颅骨，然后将一块3毫米厚的玻璃盖（Norland公司，光学粘合剂71）粘到5毫米的覆盖玻璃上。 覆盖玻璃用牙科水泥（C&B Metabond）固定，并安装了头杆。 在牙胶凝固后，将小鼠放在37°C的热垫上，直到完全康复。
在成像过程中，用异氟醚麻醉小鼠，然后将头部固定在约束装置上（目录号：MAG-11404，Narishige）。 使用25×物镜[Nikon 25×water emersion 2 mm工作距离（WD），数值孔径（NA）：1.1]，压电Z-drive（压电仪器），每10分钟拍摄一次，持续1小时，8小时后再次进行一次， 以及Scanimage4软件（Vidrio Technologies）或ThorImage软件（Thorlabs）。 成像后，按照“免疫组化”一节所述，对动物进行经心灌注。 为了在形态学上验证成像细胞的特性，使用60μm厚的振动棒制备水平脑切片，并对ZsGreen和ankyrin-G（AnkG）进行免疫染色。 如果存在明显的突触盒，则认为该细胞是ChC。 在丝状体转变为轴突支和起源于丝状体的新生支的分析中， 我们将轴突支和丝足定义为：长度大于5μm且含有附加侧支或轴索静脉曲张的突起和长度大于3μm但不包含额外侧支或静脉曲张的突起。
单细胞电穿孔与Ca 二+ /急性脑切片的结构双光子成像 为了对急性脑片中移植的CHC和内源性ChCs进行延时视频显微镜观察，用异氟烷麻醉小鼠，并用冰冷切液经心灌流，之前用95%O 2 /5%一氧化碳 2 10分钟（124毫米氯化胆碱，2.5毫米氯化钾，1.2毫米NaH 2 人事军官 4 0.5毫米氯化钙 2 ，3.3毫米氯化镁 2 ，10 mM葡萄糖和50 mM NaHCO 三 以H为单位 2 O） 一。 所有盐都是从费希尔化学公司或西格玛奥尔德里奇公司购买的。 在切割液中解剖大脑，并用切割液转移到振动台上。 接下来，制备400μm冠状脑片，并转移到培养液（125mmnacl）中 2 25毫米NaHCO 三 ，25 mM葡萄糖，2.5 mM KCl，1.25 mM NaH 2 人事军官 4 ，2毫米氯化钙 2 ，5毫米氯化镁 2 ，1mM抗坏血酸，4 mM丙酮酸钠 2 O） 含95%O的气泡 2 /5%一氧化碳 2 将组织转移到室温下培养20分钟。
对于单细胞电穿孔，由于细胞对比度更好，切片厚度调整为300μm，以形成松散的贴片。 培养后，将切片转移到装有灌注室（Warner Instruments）、微操作器（MP225，Warner Instruments）和轴孔器（Molecular Devices LLC）的Cerna显微镜（Thorlabs）。 的mPFC中的ChCs Nkx2。 1： Ai14型 用贴片吸液管对小鼠进行靶向治疗，并开始松脱贴片，然后进行电穿孔（2次脉冲，12V，0.5ms宽，500ms间隔）。 吸管含有内溶液[100 mM KCl，50 mM K-葡萄糖酸盐，10 mM Hepes，5 mM Mg-腺苷5′-三磷酸（ATP），0.3 mM Na 2 -鸟苷5′-三磷酸（GTP）和0.1 mM EGTA]，Ca 二+ 指示剂Fluo-5F（500μM；Invitrogen）和Alexa Fluor 594（500μM）。 5分钟后，移走移液管，将切片转移到配备有Mai Tai eHP DeepSee钛蓝宝石激光器（光谱物理）的双光子显微镜（Bergamo II，Thorlabs）、25×物镜（Nikon 25×water emersion，2 mm WD，NA:1.1）、压电Z驱动（压电仪器）， 以及Scanimage4（Vidrio Technologies）或ThorImage（Thorlabs）软件，成像会议开始了。 在双光子延时成像中，aCSF（125mmNaCl 2 25毫米NaHCO 三 ，25 mM葡萄糖，2.5 mM KCl，1.25 mM NaH 2 人事军官 4 ，2毫米氯化钙 2 ，和1毫米MgCl 2 以H为单位 2 O） 含95%O的气泡 2 /5%一氧化碳 2 在成像室中不断循环（华纳仪器）。 用振镜共振扫描仪在1024×1024像素深度的物镜后，以930nm的波长、30mw的最大功率采集1000帧100μm Z-stacks图像，共3小时。 分析Ca 二+ 动力学方面，每30s拍摄1小时（1024×1024像素，200帧，40μm Z-stack，930nm激发）的图像。 为了同时获得红色和绿色信号，使用分束器（562 nm）和带通滤波器（GFP，525 50/25 nm；RFP，650 40/25 nm）将发射光分成两个光电倍增管。 第一小时后（或Ca的前30分钟 二+ 成像），切片与含有特定药物的aCSF孵育，2小时后用aCSF再次冲洗（用于Ca 二+ 影像学检查，曝光后没有疗程）。 用下列物质暴露脑片：硝苯地平（Cav1.1，Cav1.2，Cav1.3和Cav1.4拮抗剂，10μM），芋螺毒素MVIIC（Cav2.1拮抗剂，10μM），芋螺毒素GVIA（Cav2.2拮抗剂，1μM），SNX482（Cav2.3拮抗剂，200nm），米比夫地尔（Cav3.1，Cav3.2和Cav3.3拮抗剂，1μM），TTX（Na通道拮抗剂，1μM）， 尼古丁（nAChR激动剂，20μM）、美沙明（nAChR拮抗剂，1μM）、阿托品（mAChR拮抗剂，1μM）、氢溴酸二氢-β-红霉素（DHβE；α4-nAChR拮抗剂10μM）、GABA A 受体阻滞剂（gabazine SR-95531，10μM）和柠檬酸甲酯乌头碱（MLA；α7-nAChR拮抗剂，40nm）。 在离体光生切片实验中，利用以λ=660 nm（±20 nm）为中心的未过滤发光二极管（M660L4，Thorlabs）发出的红光激发胆碱能纤维中的mCrimson。 光源被放置在成像室（华纳仪器）下，每30秒将切片置于50赫兹的光脉冲下3秒，持续1小时，最大功率为30兆瓦。 mPFC中单个ChC的轴突结构与胆碱能纤维重叠，如上所述。 对于假定的篮状细胞的成像，ZsGreen转染的细胞在mPFC的uL2/3处没有轴突突起的迹象，如上述移植的ChCs所述。 成像后，切片在4%多聚甲醛（PFA）中固定10分钟，包埋在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的10%明胶中，重现成60μm切片，并用PV和AnkG抗体进行免疫染色，如下所述。
丝虫病与Ca分析 二+ 双光子显微术成像的ChCs动力学 在斐济，使用体膜下100μm×100μm×100μm立方体进行丝状体分析。 为了提高信噪比，对每微米10个光学截面进行分组。 在斐济进行三维漂移校正。 为了测量长度测量中的误差，测量了五个单元中两个基准点之间的距离。 两个时间点之间的平均误差为0.2μm，标准差为0.3μm。因此，我们将显示长度差异小于0.5μm的丝状足定义为稳定。 分析中只考虑了新发丝状体。 在药理学分析中，通过手动追踪至少300μm ChC轴突来确定新形成的丝状体的密度，计算每个疗程（基线、暴露和冲洗）中沿着该追踪段新启动的丝状体数量，并将其标准化为100μm轴突。
对于Ca 二+ 影像学分析在斐济进行。 每千分尺有五个框沿 z 轴以增加信噪比，并使用三维漂移进行漂移校正。 分析Ca 二+ 与丝虫病发生有关的动力学，选择显示丝状虫起始的静脉曲张，在斐济手工勾画，平均灰度值代表Ca 二+ 信号，分别在启动前5min和启动后2.5min测量。 Δ F / F 0 计算为一个时间点的荧光信号减去会话的三个最小荧光信号的平均值除以会话的三个最小荧光信号的平均值。 药理学分析 二+ 在静脉曲张中药物暴露前7.5分钟和暴露后7.5分钟测量信号，显示在前30分钟出现丝状孢子虫。Δ F / F 0 计算为一个时间点的荧光信号减去基线会话的三个最小荧光信号的平均值除以基线会话的三个最小荧光信号的平均值。 Ca数量 二+ 通过计算所有钙来确定用药前后的水平增加 二+ Ca中的水平增加 二+ 等于或大于最小Ca的信号 二+ 与基线阶段丝状虫开始相关的静脉曲张水平增加。 最小的Ca 二+ 与丝状孢子相关的水平增加被确定为Ca之间的最小差异 二+ 信号在 ? 30和 ? 丝状孢子开始前60秒。 此外，这些Ca的振幅 二+ 用药前后平均水平升高，并进行比较。
测量Ca 二+ 急性脑片神经元胞体的动态变化 用于测量钙 二+ 在急性脑片中应用TTX前后的水平，按照描述制备三只SW小鼠的脑片，用于轴突中的钙显像，并在Fluo-5F-AM（Thermo Fisher Scientific）溶液（aCSF中为10μM）中孵育30分钟，以使皮层中的神经元大量负载。 冲洗Fluo-5F 5min后，在16.6hz下对512×512光学截面成像1min。 在光镜下孵育10分钟，然后在光镜下观察1分钟。 在斐济进行了图像分析，在那里进行了最大强度投影，以可视化细胞体，并使用魔棒工具随机选择细胞。 得到所有切片的平均灰度值，Δ F / F 0 是计算出来的，在哪里 F 0 是所有灰度值的中值。 平均Δ F / F 0 应用Wilcoxon检验比较TTX应用前后的差异。
电生理记录与分析 为了评估移植的CHC在EP13的电生理特性，进行了标准的全细胞膜片钳记录。 电极在水平燃烧的棕色微移液器（P-87型，萨特仪器）上制造，并填充过滤后的葡萄糖酸钾内溶液[浓度：145 mM葡萄糖酸钾，5 mM NaCl，0.5 mM EGTA，4 mM Mg ATP，0.3 Na 2 -GTP、10 Hepes和1%生物毒素，最终pH值为7.2和290 mosmol（Sigma-Aldrich）]。 用1μM的TTX和10μM的荷包牡丹碱建立永久性细胞外液流（aCSF），阻断钠通道和GABA A 分别是受体。 在外部溶液中，电极的电阻为5到7兆欧。 数据通过MultiClamp 700 A（Axon Instruments，Union City，CA）采集，以2 kHz的频率在线过滤，并以20 kHz的采样率采集。
在pclamp10.7（Molecular Devices LLC）中，利用10mv超极化测试脉冲，通过内置膜测试，测量了无源膜的特性（电压钳模式）。 AP的性质，发射率，和发射模式在clampfit 10.7（分子器件有限责任公司）中进行了分析。 在1s电流钳去极化步骤中产生的第一个AP被用来评估单AP的特性。 AP阈值被测量为电压轨迹中的急剧向上偏转。 AP振幅被评估为基线和峰值振幅之间的电压差。 在半最大振幅下测量一半宽度。 测量后超极化的振幅从基线到最负的膜电位峰值。
放电率和模式（电流钳模式）：使用一系列1s去极化电流步骤，以5、10或20pa的增量脉冲评估AP的重复放电。 使用Clampfit软件10.5.2.6版（分子器件有限责任公司）的事件检测（模板搜索）收集分析点火模式的尖峰间距（ISI）。 在阈上去极化步骤中进行适应性分析，在1s脉冲内达到20个APs。 在每个AP之间使用ISI（毫秒）的适配比是ISI9-10/ISI1-2除以的结果。 ISI是每一个峰值和下一个峰值之间的时间。
免疫组织化学 小鼠经腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪[氯胺酮（50 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）]并经心灌流15 ml 0.9%冷盐水，然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中20 ml 4%PFA。 将大脑解剖并在4°C下用2%PFA固定过夜，然后储存在PBS中直到进一步使用。 接下来，使用振动棒（徕卡）制备60μm冠状脑切片，在PBS中0.5%Triton X-100中渗透10分钟，然后在PBS中用0.1%Triton X-100和10%驴血清（Jackson Immunology Research）阻断1小时。 随后，将切片与主要抗体在4℃的封闭溶液中孵育过夜。使用以下主要抗体：山羊抗ChAT（1:200；milipore，目录号AB144P）、兔抗Cav3。 1（1:100；芦荟素实验室，目录号ACC-021），兔抗Cav3。 2（1:100；芦荟素实验室，目录号ACC-025），兔抗Cav3。 3（1:100；芦荟素实验室，目录号ACC-009）、豚鼠多克隆抗PV（1:2000；Swant，PVG-213）、大鼠抗血凝素（1:500；罗氏，目录号11-867-423-001）、鸡抗GFP（1:800；Abcam，目录号ab13970）、小鼠抗AnkG（1:500；UC Davis/NIH Neuromab，目录号：N106/36 75-146）， rabbit anti-ZsGreen（1:500；Clontech，目录号632474）和rabbit anti-RFP（1:800；Rockland，目录号600-401-379）。 在PBS中洗涤三步各10min后，将切片置于适当的荧光标记二级抗体中，室温下观察2小时。 所有二级抗体均购自杰克逊免疫研究所，均为驴抗特异性免疫球蛋白G（IgG）（IgY）抗体。 以1:1000的浓度使用以下次级抗体：抗鸡Alexa Fluo 488（目录号703-545-155）、抗小鼠Alexa-Fluo 488（目录号715-545-151）、抗兔Alexa-Fluo 488（目录号711-545-152）、抗兔Cy3（目录号711-165-152）、抗小鼠Cy3（目录号715-165-151）， 抗鼠Cy5（目录号715-175-150）和抗鼠Alexa Fluor 594（目录号712-585-150）。 在4°C的冲洗培养基上，将切片保存在4°C的冲洗培养基中。
固定脑标本成像 低倍率荧光图像是用配备电荷耦合器件相机（Qimaging）和QCapture采集软件的显微镜（Olympus BX51，4×UPlanSApo NA:0.16）拍摄的。 为了进行详细的结构分析，使用共焦显微镜（蔡司CLSM 880，20×平面无染色质，NA:0.8；63×PLAN无染色质油浸，NA:1.4）获得z-stack图像。
轴突分支点分析与轴突乔木重建 对于轴突分支模式的局部分析，选择含有胞体的细胞切片，并选择一个100μm×100μm的正方形，细胞的胞体位于正方形的中上部。 使用斐济图像分析软件在z-stack中手动计算轴突分支。
为了表现轴突乔木，选择一个20μm×100μm的矩形，细胞的胞体位于矩形的中上部。 在Imaris（Bitplane）中用纤维示踪工具手工重建轴突乔木。
BF神经元免疫信号共定位分析 为了确定AAV介导的BF神经元基因操作的效率，脑切片中含有BF AAV-CreD-hM3D-mCherry公司 –注射小鼠和 AAV-CreD-hM4D-mCherry公司 –注射小鼠用抗RFP抗体和抗ChAT抗体进行免疫染色。 用clsm880（蔡司，20×PLAN无染色质，NA:0.8）获得共焦z-stack。 RFP比率 + /聊天 + 使用斐济图像分析软件进行人工检查。 我们发现81±3%的聊天 + 细胞表达RFP（866聊天 + 细胞，七种动物）。
CRISPR-Cas9转染细胞的单细胞基因分型 α基因型分析 4-nAChR-sgRNA –如前所述进行转染细胞( 57).简单地说，将含有形态鉴定的ChCs的60-μm切片在PBS中的30%蔗糖中在4°C下培养过夜，并在平坦的最佳切割温度-复合块（Sakura）上快速冷冻，然后使用低温恒温器（Thermo Fisher Scientific）重新生成20-μm的切片， 并放置在聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）-膜盖玻片（徕卡）。 用激光显微切割系统（Leica）对形态学上重新鉴定的ChCs的胞体进行切割，收集在PCR管中，并用蛋白酶K（0.1mg/ml最终浓度，Ambion）在5μl的直接PCR裂解试剂（细胞）（Viagen Biotech）中消化。 经过两轮PCR扩增出sgRNA结合位点周围约150个碱基对片段后，利用注入克隆（Clontech）将该片段克隆到pBlueescript载体中。 每个细胞随机选择5个质粒克隆，用M13正向引物（Operon）进行DNA测序。 合子性测定结果如下：（1）无突变：5个克隆均显示WT序列； 克隆和等位基因突变有5个； 双等位基因突变：5个克隆包括两种移码突变。 第一次PCR所用引物包括：正向，5′-tgag-gcac-tcct-tcct-tcct-gaag-3′； 反面，5′-cagc-cact-gcca-gag-agga-tgtc-3′； 第二次PCR所用引物如下：正向，5′-cctg-aagt-ttag-tg-gctt-atcc-agc-3′； 反面，5’-gtcc cagc gcag tttg tagt catgc-3’。
统计分析 在整个实验过程中，数据以平均值±SEM表示。 所有数据都是从至少三个独立的实验、动物或大脑中收集的。 所有统计分析均使用Prism 6进行。 数据的正态分布采用Shapiro-Wilk检验。 用学生的 t 两组检验或两组以上单因素方差分析（ANOVA）。 方差分析后，采用Bonferroni事后检验分析各组间的统计显著性。 对于依赖性测量，采用Wilcoxon检验。 P 小于0.05的值被认为是显著的。 统计显著性按以下方式用数字表示： * P <0.05， ** P <0.01， *** P <0.001，以及 **** P <0.0001。
