BRN2是灵长类动物端脑发育的关键基因

　　

摘要

灵长类特有基因的进化突变推动了灵长类大脑皮层的扩张。然而，先前功能不明的保守基因是否也在灵长类动物大脑扩张中发挥关键作用仍然是个未知数。在这里，我们关注溴氮(POU3F2)，一种编码神经转录因子的基因，通常在灵长类和小鼠中表达。与对小鼠大脑发育的有限影响相比，溴氮食蟹猴的双等位基因敲除(束状猕猴)在妊娠中期前是致命的。组织学分析和单细胞转录组显示溴氮缺乏减少RGC的扩张，诱导早熟分化，改变端脑神经发生的轨迹。溴氮，作为一个上游因子，控制神经节隆起的规格和分化。另外，我们确定了溴氮从食蟹猴到人类RGC。溴氮可直接调节SOX2和车站3维护霍普克斯.我们的发现揭示了一个以前未知的机制溴氮，一个保守的基因，通过获得新的机械功能来驱动早期灵长类端脑的发育。

简介

大脑发育中的一个挑战是如何理解现存的哺乳动物，如猴子和老鼠，使用相似数量的基因，但明显拥有更复杂的大脑结构和功能(1)尤其是皮层。灵长类动物皮质扩张的特点是端脑脑室区放射状胶质细胞（RGCs）的增殖延长和增加，rgc随后扩展到脑室下区（SVZ）(2–5)在灵长类动物中，RGC比老鼠更丰富，并形成一个更为扩展的SVZ，即由“基础”RGC（bRGCs）驱动的外部SVZ(6)然而，导致灵长类rgc扩张的分子机制仍不清楚。一种理论认为，这些适应是通过基因表达的变化而进化的(7–9)识别赋予RGCs以灵长类特有的促增殖特性的遗传因素，对于阐明灵长类动物皮质扩张的特定方面是不可或缺的。一种方法需要确定哪些基因、基因组调控序列或信号通路表现出灵长类动物特有的表达模式，对RGCs具有独特的功能。

通过对哺乳动物基因组或基因表达的比较分析，我们发现了一些灵长类动物特有的分化特征，这些特征是灵长类动物大脑皮层扩张的关键。表型进化的一个驱动因素与基因表达模式的变化有关，例如骨分泌素(1);细胞外基质包括胶原蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖和整合素(10);ASPM公司(11);血小板源性生长因子D（PDGFD）–PDGFRβ（PDGFRβ）信号通路(12)第二个进化驱动力是灵长类特有的或新的基因的出现，比如特定的长非编码RNA(13)和microRNA(14),TMEM14B型(15),TBC1D3(16),诺奇2NL(17,18)，和ARHGAP11B型(19,20)这两类基因的功能获得主要是由现有基因的进化突变引起的，包括DNA调控元件的获得、氨基酸的置换和基因的复制。第三个可能的进化驱动因素是非原生物种和灵长类物种之间的保守基因，它们在灵长类动物中获得了新的功能。确定第三类基因带来了挑战，因为这些保守基因的功能在啮齿类动物模型中通常无法评估。

在我们对食蟹猴端脑发育的组织学变化的初步研究中，我们意外地发现BRN2，一种保守的真正的神经前转录因子（TF）在胚胎36天（E36）的VZ早期RGC中强烈表达（图S1），但标志着小鼠的晚期RGC和上层皮质神经元(21–23)这些结果表明，BRN2在猴端脑发育过程中的表达明显早于小鼠。因此，我们假设BRN2在猴子的端脑发育过程中起关键作用，而在小鼠早期发育过程中其功能有限。为了验证这个假设，我们制作了BRN2基因敲除猴子。通过组织学分析和单细胞测序，我们研究了以下问题：（1）BRN2在小鼠和猴皮质的时空分布差异；（2）BRN2在灵长类早期端脑发育中的作用是什么，BRN2调节灵长类动物端脑发育的可能机制是什么。

结果

BRN2标志着食蟹猴端脑发育早期的rgc

为了筛选出灵长类动物中存在但能触发新功能的关键基因，我们研究了食蟹猴的细胞发育轴和基因表达模式(束状猕猴)胚胎大脑。为此，我们首先通过免疫染色分析皮质发育过程中神经祖细胞特异性标记的表达。人神经上皮细胞（NEPCs）具有PAX6的高阳性率和SOX1的延迟表达等特殊的分子特征(24)我们观察到E29的猴神经细胞是由具有多个假分层层（图S1A）的NEPC构成的，类似于小鼠E9。5个NEPC(24)特别是，我们发现PAX6的普遍表达，但没有SOX1、EOMES（中间祖细胞（IP）标记物）和NEUROD2（神经元标记物），以及ZO-1（N-Cad介导的粘附连接的NEPC标记物）的不对称分布（图S1A）(14)相反，在E36处表达的SOX1、EOME和NEUROD2表明，NEPC已经转化为RGC（图S1B），相当于正在发育的E10中的RGC。5小鼠皮层(24)E49和E72的基因表达模式（图S1、C和D）与E12的发育皮质保持一致。5和E14。5个鼠标（图S1、F和G），由Smart总结等等。(25)还有江和纳尔德利(26).

接下来，我们检查了皮质类固醇发生特异性的一般性TFs的表达，包括EOME（一种IP标记）、NEUROD2、SATB2（皮质神经元标记物）、FOXP2（深层神经元标记物）、CUX1和BRN2（上层神经元标记物）（图S1，a到G）。SATB2的明显产物⁺皮质神经元和EOMES⁺IPs由E36 SVZ皮质板（CPs）（图S1B）和FOXP2启动⁺e49cps的深层神经元。CUX1型⁺在E72CPS中检测到上层神经元（图S1D）。出乎意料的是，BRN2作为一种上层神经元标记不仅在e72cps中强烈表达，而且从E30开始在VZ和SVZ的rgc中也有强烈表达(图1，A和B，以及图S1，B至D）。通过比较小鼠皮层神经发生(26)我们得出结论，除了BRN2在E29到E72猴皮质的神经发生阶段和表达模式与E9相似。5至E14。5小鼠皮质(图1A至C以及图S1，A至G）(25).

图1BRN2在食蟹猴皮层发育过程中的时空分布与RGC扩张的关系。

(A和B)PAX6和BRN2在猴初级视皮层冠状面扩张过程中的动态表达。BRN2最初在胚胎第30天（E30）（A）在NEPCs中表达，并在E49（B）沿VZ向SVZ逐渐延伸。皮质层通过4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和PAX6染色鉴定。(C)对E9进行Brn2和Pax6的免疫组化分析。5（顶部）和E12。5（底部）小鼠新皮质。(D)显示BRN2在E40猴初级视皮层冠状区的表达模式的图像。(E)在BRN2和brvz的双重染色中表达brv2和brvx60⁺)或BRN2缺失（BRN2^?)分区。BRN2中形成了明显的SVZ⁺区域，但不在BRN2^?区域。(F)BRN2和PAX6在BRN2中表达的定量分析⁺和BRN2^?分区。数据以平均值±扫描电镜表示(n每组计数300个细胞。(G)p-波形蛋白（PVI）和KI67在BRN2的E40 VZ和SVZ中的表达⁺或BRN2^?分区。定量数据仅来自细胞分裂发生的顶端区域的细胞。数据以平均值±SEM表示，n每组计数400个细胞。箭头表示阳性细胞。（a到d）矩形区域的放大倍数更高。(H)左边是E40的皮质图，右边是测量猴胎脑全皮层和BRN2表达细胞厚度的示意图。(我)与（H）相关的E40猴新皮质BRN2分布与皮质厚度的关系。（H）中的起始位点和侧向位点对应于（I）中的起始位点和侧向位点。蓝色，DAPI，核染色。比例尺，100μm。

BRN2在小鼠和猴皮质的时空分布差异

BRN2在早期RGCs中的表达（图S1B）揭示了BRN2可能在灵长类动物早期皮质发育的独特方面，促使我们进一步研究BRN2在猴胚胎皮层中的时空分布，从早期（E29）到中期（E72）(25).由于BRN2和BRN1在小鼠体内具有高度的保守性和相互补偿作用(22)，我们使用了一种BRN2单克隆抗体，它能特异识别BRN1中不存在的BRN2的N端肽。免疫组织化学染色显示BRN2在E30开始在外侧NEPCs中表达，到E40时，BRN2逐渐沿VZ（PAX6表达细胞）向外侧、内侧和腹侧向背侧延伸(图1，A和B和无花果。S1，A到D，以及S2，A到C）。E49的分布包括了整个皮质的VZ/SVZ，E72分布在整个皮质，包括皮质上层（图S2、B和C）。与PAX6相比⁺特别位于VZ/SVZ的电池，BRN2⁺细胞在发育过度后逐渐向皮质迁移，并在E72到达CP(图1，A和B和无花果。S1，A到D，以及S2，A到C）。这些结果表明BRN2⁺皮层神经元在E72产生。相反，我们没有观察到Brn2在小鼠E9中的表达。5皮层（图S1E）。我们第一次在E12发现它。5神经节隆起（GE），但不在皮质VZ区(图1C以及图S2D）。BRN2在E14中广泛表达。5端脑，包括VZ和CP（图S2D）。BRN2的表达模式与先前的研究结果一致(21–23)这些数据表明，BRN2在发育过程中的表达在猴皮层比在小鼠皮层开始的更早。

为了进一步验证BRN2在灵长类和非灵长类物种中的表达差异，我们使用一种已报道的分化系统[碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导]将小鼠和猴胚胎干细胞（ESCs）诱导到神经外胚层，使ESCs能够自发地分化为一般的神经上皮干细胞（NESCs）（图S2E）(27)我们发现，BRN2最初在分化后6天（pdD6）在SOX1和SOX1表达之前（图S2、F和G），BRN2首先出现在缺乏SOX1表达的小鼠pdD15 ESC衍生细胞中（图S2、H和I）。因此，BRN2在体外神经分化过程中的表达模式与体内一致。

接下来，我们研究了BRN2表达与RGC增殖和VZ扩张的关系。选择BRN2在外侧内侧/背侧VZ区分布不对称的E40皮质(图1D)我们可以评估RGC扩增与BRN2表达的相关性。与未用BRN2表示的区域相比（BRN2^?我们观察到BRN2表达区（BRN2）的VZ/SVZ增加⁺区域）(图1E).BRN2中BRN2和PAX6的双重染色和定量^?和BRN2⁺分区也支持这一结果(图1F)此外，通过P-波形蛋白（PVI）和KI67免疫染色法对根尖表面RGC的增殖率进行定量分析，发现BRN2中增殖细胞的频率增加⁺区域(图1G)提示BRN2表达与RGC增殖有关。BRN2阳性细胞层厚度与皮质厚度高度相关(图1、H和I)这一结果提示BRN2表达的发生和过程与VZ和皮质的扩张精确一致。总之，BRN2在啮齿类动物和灵长类动物之间的时空分布差异提出了一个有趣的可能性：BRN2可能在灵长类RGC增殖、SVZ扩张和端脑发育中起关键作用。

溴氮-敲除猴胎在妊娠中期前是致命的

溴氮突变不能诱导小鼠大脑皮层缺损，这是由于Brn1(22,28,29)。E14之前RGC的数量没有显著差异。5在大脑皮层中间神经元的产生和迁移中Brn1/溴氮双突变体端脑(22)为了研究BRN2在灵长类动物大脑发育中的作用，我们建立了一个双等位基因溴氮-使用CRISPR-Cas9系统的零食蟹猴模型(图2A) (30)我们筛选出两对以猴外显子为靶点的单导rna（1型：sgRNA-A+B，1-kb缺失；2型：sgRNA-A+C，0.5kb缺失）溴氮基因(图2B)由于使用0.5和1-kb缺失可能比使用sgRNA更有利于功能性敲除，我们分别将sgRNA-Cas9核酸酶复合物[核糖核蛋白（RNP）]注射到1型或2型食蟹猴胚胎中。聚合酶链反应（PCR）和测序显示95%（19/20）的1型处理胚胎在溴氮其中70%（14/20）的胚胎显示1kb大片段缺失（图S3，a和B）。所有2型处理的胚胎（12个，共12个）编辑成功，有66.67%（8/12）0.5-kb片段缺失（图S3、A和B）。因此，我们将11个1型处理的胚胎和67个2型处理的胚胎分别移植到6个和23个代孕受体中。8个胚胎（1型和2型处理的胚胎分别为10.25%、1个和7个）成功植入，但2个胚胎在4-5周流产(图2C)但在此期间，对照胚胎的着床和发育效率为26.92%（26个胚胎中的7个）。这些结果表明溴氮突变会影响胚胎存活。

图2.生成溴氮-击倒(溴氮^?/?)猴子使用CRISPR-Cas9系统。

(A)生成和分析的工作流溴氮-KO猴子。RNP，gRNA-Cas9核酸酶复合物。(B)靶基因编辑示意图。不同颜色的三角形显示sgRNAs目标的不同位置。两对sgRNA（A+B或A+C）原则上分别诱导Ⅰ型[约1091碱基对（bp）缺失]和Ⅱ型（近488bp缺失）基因突变。(C)本研究中所有胎儿的详细信息。两个胎儿（080460和081012）在妊娠期间流产，我们未能收集他们的组织进行进一步分析。(D)野生型（WT；溴氮^+/+)以及溴氮-击倒（KO，溴氮^?/?)胎儿在E29、E36和E49。插入物是猴脑的放大镜，显示在溴氮^?/?E36和E49胎儿。比例尺，3.7毫米。不，不检查。(E)用琼脂糖凝胶电泳法检测所有敲除猴的PCR产物。溴氮^+/+样本（123044-1）显示为靶基因编辑的阴性对照。P、 胎盘；B、 脑细胞。(F)BRN2和SOX1的免疫染色溴氮^+/+和溴氮^?/?猴胎皮质，证实BRN2缺失溴氮^?/?皮质。蓝色，DAPI，核染色。比例尺，100μm。IHC，免疫组织化学。

根据猴脑发育轴和BRN2的时间表达（图S1），我们首先通过剖腹产收集E29和E36胎儿进行基因分型、转录和组织学分析(图2，C至F)没有溴氮-敲除猴胎发育到妊娠中期，相当于小鼠超过E12期。我们在E49处发现严重水肿，终止妊娠。我们在E36和E49观察到明显的脑血管发育异常溴氮^?/?胎儿(图2D)综合起来，这些结果表明溴氮基因敲除在妊娠中期之前对猴胎是致命的。PCR和Sanger测序结果表明，所有基因编辑的胎儿均成功编辑并携带双等位基因突变(图2E和图S3C），这是进一步验证BRN2蛋白免疫染色(图2F).

使用两个不同的引导RNA对可以防止观察到的表型由非靶点突变引起的可能性。接下来，我们通过基因组DNA聚合酶链反应和测序，进一步评估CRISPR-Cas9系统是否在基因修饰猴体内引起其他突变。分析了20个高电位非靶点（表S1）。DNA测序证实了溴氮所有猴胎中没有可检测到的靶外效应的位点（表S1）。根据这些结果，我们得出结论溴氮基因在这些猴子身上被成功地敲除了。

溴氮缺失导致猴皮质发育异常

鉴于BRN2在早期RGC中表达，我们利用RGC标记评估RGCs的表型。我们观察到正常的端脑发育溴氮^?/?E36胎儿，表明溴氮缺失并不影响端脑的最初形成（图S4A）。免疫组化染色显示E36的胎儿有明显的缺失溴氮^?/?但在皮层中不存在，虽然PAX6的表达和RGC的增殖没有明显差异溴氮^?/?和溴氮^+/+（野生型）端脑（图S4A）。SOX2损失溴氮^?/?GEs与BRN2在早期端脑GE区的最初表达一致（图S2、B和C）。SOX2表达完全丧失溴氮^?/?E49全端脑RGC(图3A)，显示了溴氮RGC的缺失在过度发展中变得明显。SOX2需要协调溴氮作为合作因素在神经规范和NP维护中的作用(31)意味着溴氮灵长类RGC的功能可能特别有助于维持SOX2.在早期人类大脑发育期间（妊娠第10周之前），大多数RGC区是垂直方向的(32,33)因此，有丝分裂纺锤体取向的改变改变了RGC细胞数量和神经元数量(34).与溴氮^+/+皮质，RGCs溴氮^?/?通过KI67和PVI染色，皮质VZ减少了RGC的垂直分裂，而斜角分裂则协同增加(图3，B和B′) (34)结果表明溴氮缺失通过改变有丝分裂纺锤体的方向来减少RGCs的增殖。此外，在VZ/SVZ RGC中激活神经元标记物TUJ1和NEURRD2，并增加SATB2的产生⁺神经元(图3C图S4B）显示RGCs的神经元早熟分化溴氮^?/?皮质。这些数据，加上IP标记物EOMES没有变化（图S4B），表明这种早熟神经元的产生是由于rgc的直接神经发生，而不是通过IP。因为BRN2的表达与皮层的形成和扩张有关(图1、H和I)我们检测了HOPX的表达，HOPX是反映灵长类oSVZ扩张过程中bRGC丰度丰度的重要转录因子(14,35,36)HOPX在灵长类动物中的表达发生在胚胎VZ/SVZ的早期，但在皮质激素形成的中期主要在oSVZ的bRGCs中表达（图S4C）。溴氮缺陷导致VZ/SVZ的HOPX损失(图3，D和D′)这个结果意味着溴氮可能通过激活来促进RGC迁移霍普克斯总的来说，这些发现揭示了溴氮是灵长类动物与小鼠不同的RGC维持的关键。在老鼠身上，把两者都击倒Brn1和溴氮在E12抑制神经发生和从VZ迁移。5、早期过度表达溴氮原位促进RGC向上层神经元的异常命运转换(21).

图3.溴氮缺失导致猴皮层发育异常。

(A到D)采用原发性体感皮质同一区域的冠状切片对E49进行比较分析溴氮^+/+和溴氮^?/?端脑（见材料和方法）。（A） 中的SOX2和PAX6表达式溴氮^?/?和溴氮^+/+分别是皮质。（B和B′）代表性染色图像（B）和定量（B′）的PVI，KI67和DAPI溴氮^?/?和溴氮^+/+皮质细胞。DAPI染色鉴定细胞分裂方向。RGCs的分裂方向的量化数据以means±SEM表示(n每组计数100个细胞*Ptrans data-src=" 0.01). "<0.01）。（C） TUJ1和SOX1的典型染色图像溴氮^?/?和溴氮^+/+分别是皮质细胞。（D和D′）HOPX和SOX1表达式溴氮^?/?和溴氮^+/+分别是皮质。右图像是左图像的较高放大倍数。（D′）HOPX细胞从VZ区迁移到SVZ区的定量（means±SEM，n每组计数500个细胞*Ptrans data-src=" 0.01). "<0.01）。比例尺，100μm(E和F)主要神经细胞的可视化溴氮^+/+和溴氮^?/?通过统一流形逼近和投影（UMAP）分析，跨三个不同阶段的单细胞。(G)代表RGC的经典标记图(SOX2)，中间祖细胞（IP）(伊奥姆斯)和兴奋性神经元（ExN）(STMN2型)分别是。(H)每种细胞类型在皮质发育中的比例动态。(我)皮质细胞在三个不同阶段的发育轨迹。RG-IP-N（RGC-IP-to-neuron）是间接途径，而RG-N（RGC-IP-to-neuron）是直接途径。虚线显示RGCs的发展轨迹。箭头表示这些轨迹的方向。(J)在溴氮^?/?和溴氮^+/+皮质（见表S3）。代表性转录因子（TFs）、基因本体论（GO）术语和京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径。蓝色，DAPI，核染色。

进一步描绘溴氮在皮质细胞类型组成和转录谱上，我们为溴氮^+/+和溴氮^?/?在E29、E36和E49期使用液滴形成微流控装置（10X基因组学平台）的端脑(图2A以及图S2A）。经过质量控制和过滤后，我们获得了93018个最终细胞用于后续分析（图S4D）。考虑到猴子资源有限溴氮^?/?胎儿，我们首先分析了两个E29大脑，观察到两个样本之间的细胞类型组成相似（图S4、E和F以及表S2）。这些结果表明，高通量技术可用于构建端脑地图集。接下来，我们整合溴氮^?/?和溴氮^+/+三个不同阶段样本（E29、E36和E49）的细胞聚集在一起，并基于典型细胞类型特异性标记的表达水平对所有细胞类型进行注释（图S4、G至I和表S2）。

哺乳动物的新皮质包含两个主要的神经元亚群：兴奋性神经元和抑制性中间神经元。ExNs占神经元总数的80%，起源于皮层VZ/SVZ的rgc或IPs。因此，我们首先选择并整合所有RGC、IP和ExN单细胞样本溴氮^+/+和溴氮^?/?细胞跨越三个阶段来追踪它们的发育轨迹(图3，E和F)在经典标记和差异表达基因（DEGs）的基础上，我们将这些细胞群分为RGC（八簇）、IP（一簇）和ExN（四簇）(图3，E至G;图S5，A和B；以及表S3）。相比之下，我们没有观察到在细胞类型和比例上的明显差异溴氮^+/+和溴氮^?/?皮质分别位于E29或E36(图3H)。但是，与溴氮^+/+猴，E49的RGC比例显著下降，IPs和ExNs明显增加溴氮^?/?皮质(图3H与我们的组织学分析相一致。

通过分析细胞轨迹和假时间，我们发现溴氮缺乏改变了RGC发育和神经发生的轨迹和方向(图3I以及图S5C）。在溴氮^+/+皮质、RGC的发育从起始点开始遵循两条轨迹（R1或R2方向），与发育阶段无关(图3I以及图S5C）。然而，E36和E49的发展轨迹溴氮^?/?由于集群4中一个种群的丢失，皮层被破坏(图3I以及图S5C）。在溴氮^+/+皮层、神经发生在E29时遵循直接途径[RGC-to-neuron（RG-IP-N）]和间接途径[RGC-IP-N-neuron（RG-IP-N）]，但间接途径主要在E36和E49(图3I).正如所料，因为溴氮最初表达于E29之后，溴氮^?/?和溴氮^+/+E29的皮质细胞在RGC的发育和神经发生方面有着相似的轨迹(图3I)然而，直接通路主要参与了神经发生溴氮^?/?皮层细胞在E36和E49支配着整个过程(图3I)此外，假时间结果证实了分化程序的早期启动溴氮-RGC不足（图S5C）。这些结果和组织学分析一起(图3，A至C，图S4B）显示了RGC的早熟和原位神经元分化。从E49到e39，溴氮缺失逐渐导致猴皮层发育异常，符合溴氮皮层的时间表达模式。这些结果进一步证明BRN2缺失驱动了这些RGC表型。

目的：探讨其分子机制和下游基因（包括TFs）的特点溴氮，我们分析了溴氮^+/+和溴氮^?/?皮质(图3J以及表S3）。下调的转录因子与神经祖细胞有关，包括赫斯1,霍普克斯，和SOX2而上调的转录因子主要与神经源性因子有关溴氮^?/?细胞，如TBR1和卫星2与我们的免疫组化观察结果一致(图3J以及图S5，D至H）。特别地，赫斯1，Notch通路的一个重要效应因子，促进皮层祖细胞自我更新(17,37)，显示出E49的显著减少溴氮^?/?皮质，尤其是在第4簇（图S5E）。这个结果与溴氮在老鼠身上，这对赫斯1(21).与染色结果一致(图3，A和D，以及图S4A），霍普克斯和SOX2在E36中表达模式明显下降溴氮^?/?在E49时，大脑皮层和溴氮^?/?皮质（图S5、D和F）。我们的研究结果表明溴氮通过多种机制调节RGC的维持和SVZ的形成。

神经元间质发育异常溴氮^?/?猴子

皮层抑制中间神经元在皮层的发育和功能中起着至关重要的作用。灵长类中间神经元主要来源于三个不同的分子和形态学区域：内侧、外侧和尾端（分别是MGE、LGE和CGE）(38)我们观察到BRN2在整个发育过程中的表达(图4A图S6A），这让我们假设溴氮可能在神经元间的发育中起作用。我们使用了COUP-TFII（NR2F2，CGE或LGE的标记）和NKX2-1（MGE的标记）(38)]免疫染色鉴别LGE/CGE和MGE(图4B以及图S6D）。与中的LGE和MGE的清晰边界相比溴氮^+/+端脑、苏木精和伊红染色显示溴氮^?/?在E49，LGE和MGE很难区分，因为它们之间没有明显的边界（图S6，B和C）。与溴氮^+/+CGE或LGE、COUP-TFII和NKX2。1个被广泛激活溴氮^?/?GEs，包括MGE(图4B以及图S6D）。结果表明，MGE与CGE/LGE的分离受到影响溴氮^?/?通用电气公司。为了揭示潜在的表型和分子特征，我们分析了单细胞RNA测序（scRNA-seq）转录组溴氮^+/+和溴氮^?/?中间神经元。我们根据DEGs和经典标记将这些中间神经元分为10个簇，其中突出了中间神经元祖细胞（iNPs；第3、5和8个簇）和分化中间神经元（其他7个簇）(图4C;图S6、E和F；和表S4）。正如预期的那样，INP在溴氮^?/?与之相比溴氮^+/+GEs随着分化中间神经元的明显增加而显著降低（图S6G）。细胞轨迹和假时分析表明溴氮突变改变了神经元间的分化轨迹和成熟途径(图4D以及图S6H）。

图4.溴氮猴内部发育异常。

(A)BRN2和COUP-TFII染色显示BRN2广泛分布于端脑神经节隆起（GEs）。PSB，球底缘。(B)NKX2-1和COUP-TFII在溴氮^+/+和溴氮^?/?GEs，显示COUP-TFII在溴氮^+/+而CGE/LGE在整体上明显被激活溴氮^?/?GEs（包括LGE/CGE和MGE）。部分溴氮^+/+和溴氮^?/?来自于等效的冠状面（细节见材料和方法）。(C)用UMAP分析显示中间神经元和中间神经元祖细胞（iNP）的主要类别。(D)中间神经元和iNPs的发育轨迹表明BRN2的丢失改变了中间神经元的发育轨迹。第3簇细胞明显减少溴氮^?/?猴子。(E)之间溴氮^+/+和溴氮^?/?中间神经元和iNPs（表S4）。有代表性的转录因子（TFs）、GO术语和KEGG途径。(F和G)BRN2段^+/+和BRN2^?/?端脑来自相同的冠状面。（F和G）HOPX和SOX1的代表性染色图像溴氮^+/+（F） 以及溴氮^?/?（G） 通用电气公司。F1和G1是（F）和（G）中方块的放大倍数。(H)PAX6和SOX2在溴氮^+/+和溴氮^?/?通用电气公司。(我)SST和NKX2-1在溴氮^+/+和溴氮^?/?分别是GEs。(J)钙视网膜蛋白（CR）在溴氮^+/+和溴氮^?/?端脑。箭头指示CR中间神经元的迁移方向。所有免疫荧光图像均来自端脑头端尾侧的冠状切片。刻度条，500μm。蓝色，DAPI，核染色。

通过比较分析，我们鉴定了DEGs和转录因子，包括霍普克斯,SOX2，和赫斯1，它们在溴氮^?/?通用电气公司(图4E和表S4）。在溴氮^?/?中间神经元与细胞分裂和增殖一致，而激活的基因则在轴突引导和神经发生中富集(图4E)为了进一步了解表型，我们观察了簇的变化，观察到一个细胞群[cluster 3（C3）]在溴氮^?/?中间神经元(图4C以及图S6G）。特别是一些基因，比如霍普克斯和赫斯1，在C3群体中特异表达溴氮^+/+E49的单元格(图4E以及图S6I），这意味着溴氮可以调节这些基因。免疫组化显示HOPX表达于细胞间的迁移流中溴氮^+/+MGE公司(图4F)，鉴于溴氮null导致区域中的HOPX丢失(图4G)这些数据表明C3是由这些HOPX产生的⁺迁移流中的细胞。与皮层相似，GEs中SOX2的表达也受到明显的抑制溴氮缺陷(图4H以及图S6I）。这些结果表明BRN2是维持iNP所必需的，而BRN2的缺乏促进了中间神经元的早熟产生。

鉴于大多数灵长类新皮质γ-氨基丁酸能（GABAergic）中间神经元起源于MGE或LGE/CGE(38)我们检查了欧洲的两个区域。在MGE中，有两条主要途径控制着中间神经元的发育(39).NR2F1MGE标记物在溴氮^?/?细胞（图S7A），这促使进一步评估这两种途径的变化。第一条路径是NKX2-1/LHX6-SOX6/SATB1转录级联对MGE中间神经元的产生至关重要(40)如预期，这些基因表达模式在溴氮^?/?细胞（图S7B），这意味着通路激活。另一个途径是同源域TFs的DLX家族，它被认为是中间神经元发育的基因调控网络的核心(40)我们观察到溴氮缺乏明显激活DLX基因网络，促进包括生长抑素（SST）在内的神经元间分化(图4I以及图S7C）。

接下来，我们研究了LGE/CGE中中间神经元的发生。在灵长类动物中，大部分CR（calretinin）神经元起源于LGE和CGE，而LGE和CGE衍生的中间神经元则优先占据皮层浅层(38)在LGE中，BRN2和NR2F2（COUP-TFII）呈排他表达(图4A)COUP-TFII的表达明显增加溴氮^?/?提示BRN2可能通过维持RGCs来限制NR2F2的表达。溴氮缺陷激活的CGE标记，包括NR2F2(41),NFIB公司，和阿皮斯2(42) (图4B以及图S7D），随后促进分化，向皮质浅层迁移，以及CR中间神经元的新皮质分布(图4J以及图S7E）。此外，中间神经元发育异常是由溴氮这种缺陷在端脑发育过程中越来越明显。因此，溴氮作为一个上游因素控制着整个灵长类动物GEs内部神经元的发生。

溴氮显示了人类RGCs的保守功能

调查溴氮我们分析了人类神经诱导过程中BRN2的时间表达。如预期，BRN2在人类早期NESCs中表达，其表达模式与灵长类动物高度一致（图S8A）。然后我们生成了一个溴氮^?/?通过基因编辑从两个不同的克隆中获得人胚胎干细胞(图5A)然后按照程序将这些细胞分化成NESCs(43)产生皮质类器官(图5B).溴氮缺陷不能影响人NESCs的生成和典型的两层神经外胚层结构的形成(43) (图5B以及图S8，B到D），这意味着溴氮不需要人类神经外胚层的产生，这与BRN2在猴体内的功能一致。经过20天的培养和诱导，溴氮^+/+NESCs进一步自组织成皮质类器官，94%的细胞呈VZ样结构，表达典型NP特异性标记，形成符合N-CADHERIN和ZO-1极化分布的NESC极性(图5、B和C，以及图S8，B至D）(43).相比之下，几乎所有的类有机物溴氮^?/?NESCs失去了NESC的极性和特性，随后无法产生皮质类器官(图5、B、C和G，以及图S8D）。

图5.溴氮猴RGCs的功能对于人类RGCs是保守的。

(A)发电示意图溴氮-击倒(溴氮^?/?)CRISPR-Cas9基因编辑的人胚胎干细胞（ESCs）。(B)利用人类野生型产生皮质类器官(溴氮^+/+)以及溴氮^?/?电子稳定控制系统显示溴氮^?/?ESCs失去了产生皮质类器官的能力。上面板显示皮质类器官生成图。(C)神经上皮标志物在皮质类器官中的表达溴氮^+/+和溴氮^?/?电子稳定控制系统。(D)增殖标志物KI67和PVI在乳腺癌中的比较溴氮^+/+或溴氮^?/?皮质类器官。DAPI染色鉴定细胞分裂方向。(E)细胞分裂方向的定量研究溴氮^+/+和溴氮^?/?皮质类器质细胞（平均值±SEM，n每组分别计数200个细胞）。(F)CUX1（一种上层神经元标记物）和FOXP2（一种深层神经元标记物）表达的比较溴氮^+/+和溴氮^?/?皮质类器官。(G)FoxCux1-，和FoxPax2-细胞中阳性细胞的定量溴氮^+/+和溴氮^?/?皮质类器官。数据以平均值±SEM表示，n每组计数300个细胞*Ptrans data-src=" 0.05. "<0.05。比例尺，100μm。

我们还观察到溴氮通过KI67和PVI染色发现，丢失导致RGC增殖减少，垂直分裂减少，斜角分裂增加(图5，D和E) (34)分化试验表明溴氮缺失促进了深层神经元的早期生成(图5，F和G，以及图S8D）。因此，溴氮是人体RGC维护所必需的。

机制溴氮调节灵长类动物端脑发育

因为Brn1可以弥补溴氮当溴氮已删除(22,28,29)，我们分析BRN1未观察到表达上调BRN1在里面溴氮^?/?人胚胎干细胞衍生的皮质类器官或猴胚胎皮质细胞(图6，A和B)这些结果表明溴氮删除操作无法更改BRN1在灵长类和人类中的表达。这些结果表明，SOX2的显著降低是在E36中首次发现的溴氮^?/?猴皮质（图S4A）。因此，我们推测溴氮可以通过直接激活来调节RGC的扩张SOX2.使用全基因组染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）对发育中的人皮质和人胚胎干细胞来源的NESCs进行测序(43,44)，我们确定了BRN2的直接目标（图S9A）。我们发现溴氮在启动子区SOX2(图6C，图S9B和表S5），一个维持RGC特性的关键基因。这个结果表明溴氮可通过直接监管SOX2表达式。此外，HOPX是bRGCs的关键标记(14,35,36)，完全迷失在溴氮-击倒猴子端脑。但是，我们没有检测到溴氮在霍普克斯（表S5），意味着溴氮可调节霍普克斯间接表达。我们注意到溴氮可以结合到车站3(图6D以及图S9C）。车站3对维持人脑bRGC至关重要(35,45)可能是一个上游因素调节霍普克斯(35,45,46)此外，单细胞数据显示车站3表达明显受到抑制溴氮^?/?皮质(图6E).总之，溴氮可能是灵长类神经发育早期的一个关键因素，可能通过多种潜在机制发挥作用(图6F).

图6.监管机制溴氮灵长类端脑发育研究。

(A和B)比较BRN1表达式介于溴氮^+/+和溴氮^?/?人胚胎干细胞衍生的皮质类器官（A）及其之间溴氮^+/+和溴氮^?/?猴皮质细胞（B）。数据以平均值±扫描电镜表示(n=3）。NS，没什么意义，P(C)基因图显示BRN2、聚合酶II（Pol II）和对照（IgG）的密度SOX2人类大脑皮层的启动子，表明溴氮结合到SOX2. (D)基因图显示BRN2、Pol II和对照（IgG）的密度车站3人类大脑皮层的启动子，表明溴氮调节车站3通过直接结合到车站3. (E)比较车站3中的表达式溴氮^+/+和溴氮^?/?大脑皮层在溴氮^?/?皮质**Ptrans data-src=" 0.01. "<0.01。(F)总结溴氮猴端脑发育的调控机制。aRGC，顶端RGC。线的厚度和细度分别代表强活动和弱活动。箭头表示激活，三叉戟线表示压制。

讨论

利用猴敲除模型和人类器官分析，研究了大鼠卵巢癌的时空表达和功能溴氮在端脑发育过程中，灵长类动物和小鼠之间表现出明显的差异。BRN2在早期胎猴新皮层和GEs中由VZ/SVZ的RGCs表达，早于小鼠的RGCs(图1，A至C和无花果。S1，A到G，S2，A到D）(21).变异溴氮对妊娠中期前的猴胎是致命的，通过降低RGC的增殖导致新皮质和GEs的异常发育，并促进ExNs和interneurons的早熟发生。相反，溴氮基因敲除小鼠在出生前不会导致胎儿死亡或大脑皮层神经元丢失(22,29)此外，我们还揭示了溴氮调节灵长类动物大脑皮层的发育(图6)总的来说，我们证明BRN2是一种保守的转录因子，与小鼠相比，在猴子身上获得了新的和更重要的功能。我们的研究发现溴氮对于发育中的灵长类端脑来说，这可能揭示了灵长类早期端脑发育的未知机制。

尽管溴氮对灵长类和小鼠的神经发育都有贡献，其功能在物种间有明显差异。在老鼠身上，溴氮这种缺陷只在有限的脑区出现异常，主要是在下丘脑视上核和室旁核(22,29)，同时溴氮灵长类动物的缺陷导致大脑皮层和GEs的异常。在溴氮-敲除小鼠下丘脑视上核和室旁核的细胞也不能分化为成熟的神经元，导致出生后10天内死亡(47).相反，变异了溴氮在妊娠中期前对猴胎儿造成致命性影响，通过降低RGC的增殖导致大脑皮层和GEs的早期异常发育，促进ExNs和interneurons的早熟发生。

阐明灵长类动物大脑皮层的细胞和分子结构对于理解我们的认知能力和疾病易感性至关重要。尽管取得了一些成功，但我们才刚刚开始阐明定义灵长类大脑的进化过程中发生的基因变化(7).新皮质扩张的进化变化可能在不同的层次上使用了多个过程(48)包括基因调控元件的变化和基因组的变化，从点突变到整个基因重复。这些变化包括基因表达的改变，产生具有新功能的基因(9)导致灵长类特有基因的出现(1,15,17–20)进化功能的相关变化可能是由于获得基因突变而引起的，这些突变在同一细胞中诱导了改变或新的功能(9)在研究中，我们注意到溴氮灵长类动物的大脑发育与这些报道的机制不同。BRN2蛋白在不同物种间高度保守（图S9D），这意味着BRN2在小鼠和猴皮质之间的时空分布差异并不是由于BRN2蛋白序列的进化引起的。我们的研究结果支持了这样一个观点：在灵长类动物进化过程中，基因的不同时空分布在驱动端脑扩张中起着重要作用。我们假设这样的分布使得先前未知的基因功能出现。因此，我们的发现揭示了灵长类动物端脑发育的一种先前未被确认的进化机制。此外，小鼠和灵长类动物之间BRN2表达模式和功能的差异意味着灵长类动物的大脑发育在小鼠中的重现性较差。我们的发现强调使用物种特异性的基因模型来理解灵长类动物的大脑发育。

皮质神经元通过直接或间接的神经发生产生，分别来自RGCs或RGCs-IPs。在灵长类皮质，间接神经发生（RGCs-IPs神经元）贡献了大部分神经元。我们发现了溴氮缺失诱导VZ-RGCs原位分化，并将间接神经发生转变为直接神经发生（RGCs神经元）。我们推测有几种可能的机制调节这些表型(图6F)首先，SOX和POU因子之间的相互作用在所有后生动物中都是保守的，在胚胎发育中起着关键作用。在这项研究中，我们注意到SOX2，而不是SOX1，在溴氮^?/?猴子RGC，和溴氮直接绑定SOX2发起人(图6C以及图S9B）。这些发现，再加上E30后RGC中BRN2的表达，暗示溴氮部分通过保留SOX2决定猴子RGC命运的表达式。第二，HOPX，灵长类bRGCs的关键标记(35,36,49)在E49中不存在溴氮^?/?皮质。我们的调查结果显示溴氮缺陷诱导的HOPX丢失随后抑制了RGC从VZ的分离。霍普克斯⁺灵长类动物新皮层中的rgc比发育中的小鼠新皮层中的低丰度明显丰富(36,50)此外，我们的芯片序列数据显示，来自发育中的人类大脑皮层和人类神经干细胞溴氮绑定车站3.车站3据报道，是RGC扩张的一个关键决定因素，伴随着人脑中RGC数量的增加(35)然而，这些发现需要额外的详细的机械方面的见解。

间神经元发育异常溴氮^?/?猴子。我们对皮层中间神经元发育的认识主要来自于老鼠的研究。小鼠和灵长类动物中间神经元的发育非常相似，但在形态、基因表达和特定中间神经元亚群比例方面存在重要差异(32,33)皮层中间神经元主要来源于MGE、LGE和CGE。尽管在灵长类动物中存在着皮层中间神经元和标记MGE和LGE/CGE区域的下游因子的一些发育和功能多样化(32,38)，控制MGE和LGE/CGE规格和分离的上游调节器仍然未知。我们的发现表明溴氮缺陷显著上调包括MGE在内的所有GEs中COUP-TFII的表达，这使得LGE和MGE无法区分。这个结果表明溴氮是MGE和LGE/CGE规范所必需的，而对小鼠的GEs没有影响。据我们所知，我们现在透露溴氮作为一个上游因子，控制灵长类动物的MGE和LGE/CGE规格。因此，我们提供一个例子来强调直接研究灵长类大脑对进一步阐明灵长类皮层中间神经元发育的重要性。

这里提供的数据提供了对溴氮-诱导端脑皮质发育。这些研究为揭示灵长类RGC增殖和中间神经元发育的机制奠定了基础。然而，调控时空分布或下游信号传导的调控元件溴氮我们还需要进一步的研究，不幸的是我们没有发现溴氮妊娠中期致死后猴神经发育的功能。今后的工作应该发展归纳溴氮有条件地淘汰猴子来解决这些问题。

材料和方法

动物伦理声明

雌性食蟹猴(M、 束状体)研究对象为5～8岁，体重4～6kg。所有动物均被安置在云南省灵长类生物医学研究重点实验室（LPBR），在美式标准笼中按12小时/12小时的光/暗周期进行单独饲养。所有动物程序均事先获得云南省重点保护区动物保护和使用委员会的批准，并按照国际实验动物护理协会灵长类动物伦理治疗评估与认可协会的规定执行。

剖腹产与胎儿采集

如前所述，剖腹产收集了食蟹猴六个产前发育阶段（妊娠期29、30、36、49、55和72天）的胎儿(51).

组织加工与免疫组织化学

收集胎儿后，固定脑组织；依次用10、20和30%（w/v）蔗糖溶液渗透；嵌入OCT（最佳切削温度化合物；樱花，4583）；在徕卡低温恒温器上以10～15μm的厚度切片。对于E29、E30和E36的样本，从胚胎猴身上分离出前脑突起，并以10μm厚的切片横跨大脑的头端尾侧。对于E40、E49、E55和E72的样本，分离出右侧胚胎半球，并在15μm厚的范围内对大脑的吻尾侧进行切片（图S2A）。对于免疫组化，切片组织在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤两次，用0.2%Triton X-100（Gibco，85112）过夜，在PBS中洗涤三次，在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA；Solarbio，A8020）阻断1小时。载玻片与一级抗体孵育过夜，在PBS中洗涤，并在室温下在含有Alexa Fluor 488–、594–或647–结合二级抗体（1:600；Invitrogen）的封闭缓冲液中培养2小时。在1:200至1:2000使用了以下一级抗体：SOX1，山羊（AF3369，研发系统）；DCX，小鼠（MABN707，密理孔）；TBR1，兔（AB10554，微孔）；TUJ1，小鼠（MAB1637，milipore）；NESTIN，小鼠（MAB5326，milipore）；TBR2，兔（ab23345，Abcam）；N-钙粘蛋白，兔（GTX127345，GeneTex）；PAX6，兔（901301，生物传奇科文斯）；IBAL1，兔子（019-19741，Wako）；COUP-TFII，鼠标（PP-H7147-00，研发系统）；霍普克斯，兔（HPA030180，Sigma-Aldrich）；NeuroD2，兔（ab104430，Abcam）；GFAP，兔（z03429-2，达科）；SST，小鼠（sc-55565，圣克鲁斯生物技术公司）；GAD65，小鼠（ab26113，Abcam）；BRN2，兔（12137S，细胞信号技术）；NKX2。1、兔（AB76013，Abcam）；波形蛋白，兔（14-9897，eBioscience）；ZO-1，小鼠（01-107，Invitrogen）；PVI，小鼠（D076-3S，MBL国际）；CUX1，兔（SC13042，圣克鲁斯生物技术公司）；FOXP2，兔（ab16046，Abcam）；SATB2，小鼠（ab51502，Abcam）；米利替宁，小鼠；SOX2，兔（AB5603，milipore）；和KI-67，兔子（PA5-19462，Invitrogen）。

免疫组化采用全脑10～15μm冠状切片。确保BRN2段^+/+和BRN2^?/?从等效的日冕水平，我们使用以下方法。首先，将整个大脑的各个部分按位置顺序进行编号，然后按位置均匀地分为前、中、尾三个部分。第二，在每个部分的正中选择两个玻片同时染色。中间部分的染色如所示图4B以及图S6（B和C），而尾端部分染色如图S6D所示。

gRNA的制备

针对BRN2外显子的sgrna是由网站上的chop-chop在线软件设计的https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design选择得分最高的前五名（表S1），并使用GeneArt Precision gRNA合成试剂盒（Invitrogen，A29377）在体外扩增和转录sgRNA寡核苷酸。这五种sgRNAs在成纤维细胞上的转染效率首次得到验证，并选择其中三种效率较高的sgRNAs进行胚胎编辑。

卵母细胞采集与体外受精

卵母细胞收集和受精如前所述(52)总之，选择10只5～8岁月经周期正常的雌性食蟹猴作为卵母细胞供体进行超数排卵，肌肉注射rhFSH（重组人卵泡素α，GONAL-F，Merck serino）8天，rhCG（重组人绒毛膜促性腺激素α，OVIDREL，Merck serino）于第9天进行。给药后32～35h，采用腹腔镜卵泡抽吸法采集卵母细胞。trans data-src="Follicular contents were placed in Hepes-buffered Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP) medium (Caisson Labs, IVL01) containing 0.3% BSA at 37°C. Oocytes were stripped of cumulus cells by pipetting after brief exposure (1 min) to hyaluronidase (0.5 mg/ml) in TALP-Hepes to allow visual selection of nuclear maturity metaphase II "将滤泡内容物置于37℃下含有0.3%牛血清白蛋白的Hepes缓冲酪氨酸白蛋白-乳酸-丙酮酸（TALP）培养基（Caisson Labs，IVL01）。在短暂暴露于TALP Hepes中的透明质酸酶（0.5 mg/ml）后（<1分钟）通过移液管从卵丘细胞中剥离卵母细胞，以允许肉眼选择核成熟中期II（MII；第一极体存在）卵母细胞。

RNP注射、体外受精、胚胎培养和移植

成熟卵母细胞立即进行胞浆内单精子注射（ICSI），然后在含有10%胎牛血清（FBS；Invitrogen，16140071）的CMRL-1066中培养，培养温度37°C，浓度5%CO₂受精通过第二极体和两个原核的存在得到证实。生产溴氮-敲除胚胎，在ICSI前，我们将一对sgRNA（2500ng/μl，1250ng/μl）和Cas9核酸酶（5000ng/μl；Invitrogen，A36499）混合注入每个卵母细胞，ICSI前注入总体积为5pl。在标准条件下，用微量注射系统在卵母细胞胞浆中进行微量注射。然后将受精卵（野生型和BRN2-RNP处理）培养在含有10%FBS（Gibco，16140071）的化学定义的仓鼠胚胎培养基-9（HECM-9）中，在37℃和5%CO中培养₂使胚胎发育。每隔一天更换培养基，直至囊胚期。将两细胞至囊胚期的高质量卵裂胚胎移植到受体猴的输卵管中。38只猴子被用作代孕受体。最早的妊娠诊断是在胚胎移植后20天左右通过超声检查。临床妊娠和胎儿数量均由胎儿心脏活动和超声检测到的卵黄囊的存在来证实。

基因组DNA提取及基因分型

根据制造商的说明，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega，#A1125）从突变和野生型胎儿组织中提取基因组DNA。用REPLI-g单细胞试剂盒（QIAGEN，150345）扩增胚胎基因组。PCR在95℃下进行5min；在95°C下进行35次循环30 s，64°C（每个循环下降到0.2°C）30 s，72°C下2.5 min；对于I型样品，72°C持续10分钟，或95°C持续5分钟；对于II型样品，在95°C下30 s，59.5°C下30 s，72°C下1 min，和72°C下10 min下循环35次。引物如下(溴氮-L-F/R和溴氮-I型和II型样品的F/R）：溴氮-L-F，5′-cagcagtagc-3′；溴氮-L-R，5′-TTGGATAAAGCGGGTAGA-3′；溴氮-F、 5′-tggcgaccgcaggtctaac-3′；溴氮-R、 5′-ttgccatacagtgcccagag-3′。PCR产物经Sanger测序后进行分析。为了确定是否存在嵌合体，在测序之前，将PCR产物进一步克隆到载体Topo克隆（TSINGKE，007VS）。

目标外分析

我们使用在线工具casoffinder搜索潜在的非目标位置和序列(53) [www.rgenome。net/cas办公室/;选择短尾猕猴（5.0）作为生物类型和基因组。在错配数等于或小于3，DNA/RNA膨胀大小等于或小于2387和516的条件下，提供了潜在的靶位点（表S1）。选择20个具有高失靶潜力的位点进行PCR扩增（PCR酶产品编码为青科TSE004，引物详见表S1）并测序。这些地点的选择原则如下。相关报道表明：（1）原间隔基元-邻近基序（PAM）近端错配比PAM远端错配耐受性差；（ii）位于PAM上游+4到+7位置的序列对目标失配非常敏感；（iii）Cas9对3个靶点的DNA扩增具有耐受性：来自PAM的7个碱基、5′端（PAM远端）和3′端（PAM近端）；（iv）靠近PAM的sgRNA突起倾向于阻止卵裂(54,55).

单细胞悬液制剂

单细胞分离主要如前所述(56)简单地说，将猴胎的端脑（整个前脑突起在E29和E36处采集，左半球在E49处采集）用脱氧核糖核酸酶I（10 U/μl）（10 mg/ml；Roche，11284932001）、胶原酶IV（2 mg/ml；Gibco，17104-019）在冬眠培养基（Invitrogen，A1247601）中解剖，木瓜蛋白酶（10毫克/毫升；沃辛顿，LS003118）。将细胞悬浮液涡流并在37℃下保持10分钟，然后在140℃下离心g5分钟以获得细胞颗粒。最后一个颗粒被保存在最后一个500的冰室里。

用于高通量测序的10X RNA文库制备

按照10X基因组学的指导手册进行高通量scRNA序列分析。将单个细胞重新悬浮至100万个/ml浓度的PBS中，并添加0.04%BSA，然后将16.7μl悬浮液装载到每个10X铬道中。WT-E36和WT-E49使用10X铬通道v2，而其他样品使用10X铬通道v3，因为更新套件后v2的套件不可用。用生物分析仪（安捷伦2100生物分析仪）检查互补DNA（cDNA）文库，以进行质量控制。在文库准备之后，用NovaSeq S6000对样本进行测序。对每个细胞的库进行测序，平均深度为25000到50000次。

单细胞生物信息学分析

测序读数与M、 束状体（5.0版）使用Cell Ranger参考基因组（3.0.2版）(57)并用默认参数计算10x基因组提供的管道。在下面的分析中，唯一分子标识符（umi）少于500个、umi超过4500个或表达线粒体基因片段超过5%的细胞被丢弃。将UMI计数标准化为每个细胞10000个计数，并转换为对数刻度（Seurat函数NormalizeData）。批处理、条件和个人识别信息作为元数据添加到最终的Seurat对象中；使用ScaleData函数回归出nUMI和batch。DoubletFinder V2删除了细胞双倍体。0(58)假设我们的数据中有10%的双峰，其他参数为主成分（PCs）=1:30，而参数选择对于人工双峰数（pN）=0.25。通过find独立估计每个样本的PC空间邻域大小（PK）值。pk功能。然后结合野生型进行标准积分分析(57)分别在E29、E36和E49中敲除大脑样本，dim=1:30和anchor。在FindIntegrationAnchors函数中将功能设置为6000。计算整合数据集中的高变异基因，作为主成分分析的输入。显著主成分用于基于下游图的半无监督聚类（FindClusters函数），然后使用统一流形逼近和投影（UMAP）降维将这些种群投影到二维。在聚类方面，根据Seurat准则，在细胞数量的基础上近似计算了间接控制簇数目的分辨率参数；将分辨率参数向量传递给FindClusters函数，选择建立具有不同标记基因表达的可识别聚类的最佳分辨率(59trans data-src="). To identify marker genes, the clusters were compared pairwise for differential gene expression using the Wilcoxon rank sum test for single-cell gene expression (FindAllMarkers function, min.pct = 0.4, min.diff.pct = 0.3, and false discovery rate 0.05). ").为了识别标记基因，使用单细胞基因表达的Wilcoxon秩和检验，对聚类进行基因差异表达比较（FindAllMarkers函数，min.pct=0.4，min.diff.pct=0.3，错误发现率<0.05）。为了给这些亚群分配身份，我们将他们的标记基因与文献中已知的脑细胞亚型标记物交叉引用，神经祖细胞的PAX6，神经元的STMN2等。从每个时间点提取神经元/RG（径向胶质细胞）、中间神经元和小胶质细胞/内皮细胞的聚类数据，然后将所有时间点相同细胞类型的数据整合在一起。然后对剩余的细胞重复聚类方法。重新聚类分析如上所述。用于中的DEG分析溴氮-剔除组中，FindMarkers函数同时用于野生型和溴氮-敲除细胞的参数如下：Wilcoxon秩和检验，min.pct=0.25，logFC。阈值=1。额外调整Ptrans data-src="value (Bonferroni correction) cutoff of 1 × 10"值（Bonferroni校正）截止值<1×10^?10被用来识别DEGs。

关于E36和E49试剂盒不同的问题，本研究使用了V2和V3两种试剂盒，通过改进我们的分析方法可以消除V2和V3试剂盒引起的差异。为了减少不同试剂盒的批量效应，我们利用scRNA-seq整合方法分析了Seurat的单细胞表达数据。该管道可识别处于匹配生物状态（“锚”）的跨数据集对，并可用于校正数据集之间的技术差异（即批处理效应校正）和在实验条件下执行scRNA序列比较分析。我们还独立于其他细胞分析RGs和中间神经元，以减少潜在的批效应。

细胞轨迹分析

如教程中所述，使用Monocle3 alpha软件包执行伪时间和轨迹分析(http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/monocle3)将Seurat输出的UMAP投影数据传输到monocle进行细胞可视化。

成立溴氮基因敲除ES细胞系

对于BG02 ES溴氮敲除，sgRNAs被设计成以BRN2外显子为靶点(图5A)利用在线CRISPR设计工具对sgRNA进行了设计(https://zlab.bio/guide-design-resources)，并克隆到Pgl3-U6-2sgRNA-ccdB-EF1a-Cas9ZF-IRES（Addgene，115519）载体中。用F-5′-accgggcatgcaggcaggcgcggg和R-5′-aaacccgcgcccctgtgcTgcatgccSGRNA序列克隆到该载体中。然后，将sgRNA载体电穿孔到BG02-ESCs中。电穿孔12小时后，取出培养基，加入3μM Y-27632（Selleck，S1049）的新鲜灵长类ES细胞培养基。两天后，用嘌呤霉素（1μg/ml；美伦，MB2005）短暂孵育48小时。在嘌呤霉素筛选后1周，筛选出存活的菌落。

神经诱导和类器官生成

将灵长类esc（包括人BG02和猴CES1）培养在CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上(60).小鼠细胞系C57 ESC用含有15%FBS（Gibco）、1%非必需氨基酸（NEAA）（Sigma-Aldrich，11140050）、1%谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，25030081）、LIF（1000 U/ml；PeproTech）的敲除Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，10829-018）的培养基维持在MEFs上，和0.01?-巯基乙醇（Invitrogen，21985023）。

对于神经诱导，研究中使用了两种系统。首先，我们遵循先前制定的协议(43)简单地说，ESC被消化成小团，转移到一个低细胞粘附的六孔板中，使用神经诱导介质包括Neurobasal（Gibco，21103-049）/DMEM/F12（Gibco，10565-018）=1:1，1×B27（Gibco，17504-044），1×NEAA，1%谷氨酰胺，3 mM CHIR99021（Selleck，S2924），5 mM SB431542（Cellagentec，C7243），维生素C（50 mg/ml；默克色拉诺，A8960）、bFGF（10 ng/ml；密理博，GF003AF）、0.2 mM化合物E（密理博，565790）和0.1 mM LDN193189（Cellagen Technology，S2618）。对于第二个系统，按照已公布的方案进行神经诱导(27).

皮质类器官生成如下。人BG02胚胎干细胞用胰蛋白酶（Gibco，12604021）分离成单个细胞，然后以每孔5000个细胞的密度转移到低细胞粘附96孔板中，从第0天到第6天共有150μl神经诱导培养基。这些神经球立即形成并重新聚集。在第6天，用NSC培养基[神经基础培养基剩余B27、N2和NEAA；1%谷氨酰胺；3 mM CHR99021；5 mM SB431542；bFGF（10 ng/ml）和hLIF（1000 U/ml）]转移到超低粘附性的六孔板中。培养基每2～3天更换一次。第20天，用1×N2、1×B27、1×NEAA和1%谷氨酰胺的神经基础培养基代替分化培养基，每3天更换一次。

细胞免疫细胞化学

细胞用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，再用0.2%Triton X-100处理20min，再用PBS洗涤3次，室温下在3%BSA封闭缓冲液中孵育30min。细胞在4℃下与一级抗体孵育过夜。第二天，用PBS洗涤细胞，并用Alexa-Fluor 488-、594-、或647-结合二级抗体培养。

mRNA提取和qRT-PCR

对于定量逆转录聚合酶链反应（qRT PCR），使用三唑醇从不同样本中分离总RNA（Invitrogen，15596026），根据制造商的方案，用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒（Takara）保存cDNA，并用SYBR-Green-PCR Supermixes（Bio-Rad，CFX-Connect-Real-Time System）制备qRT-PCR（Bio-Rad，CFX-Connect-Real-Time System）。用于半定量PCR的引物如下。将管家基因β-actin扩增作为基因表达分析的内部对照。基因引物如下：β-肌动蛋白，F-cttagttgcgttacctcttc；R-acccttcaccgtttccagttt；BRN1，F-acgtctctcgcagtgggg；R-CTGCGCCCTGGCTTCACT。

芯片排序

溴氮从猴胚胎脑中扩增cDNA，克隆到pMXs-IRES-GFP逆转录病毒载体（Addgene，72876）。扩增所用引物如下：溴氮F、 5′-CGCGGATCAGTGGCGACCGC-3′；溴氮R、 5′-CCGCTCGAGTCACTGGACGG-3′。病毒包括溴氮在293T细胞中产生，并用先前报告的方案从BG02 ESCs中获得感染的NESC(61).

如前所述，对妊娠第9周流产胚胎的胚胎干细胞和人类发育皮质进行芯片序列分析(62)简单地说，根据制造商的协议，使用Illumina的TruePrep索引套件V2（Vazyme，TD202）收集了大约100000个细胞，并对其进行了处理，以备文库。

芯片序列分析

galaxyweb服务器被用来分析我们的芯片seq数据(62)。BRN2芯片seq和IgG控制数据都与内置的人类hg38基因组一致，使用bowtie2默认设置。映射后，用MACS2 callpeak软件调用BRN2结合峰。这些峰值由PAVIS在线服务器注释(63).

统计分析

定量数据用GraphPad Prism表示为平均值±SD。采用三个独立实验进行统计，具体按图例、材料和方法进行。两个样本之间的显著差异用t测试。Ptrans data-src=" 0.05 was considered as the significantly statistical difference."<0.05为显著统计学差异。