HPV不是宫颈癌的唯一罪魁祸首？沙眼衣原体也是一个帮凶！

　　

宫颈黏膜是抵抗病原体侵入女性上生殖道的保护性屏障，常受到病原体入侵和失调的挑战。

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，是威胁妇女健康的第二大“癌症杀手”，仅次于乳腺癌。

在一些国家，每年有大约13.2万名新的宫颈癌患者，约占全球宫颈癌新病例总数的一半，多达5.3万名患者死于宫颈癌。

宫颈癌严重威胁着我国妇女的健康。

众所周知，HPV是促进宫颈癌发生发展的重要病原体。

但研究表明，尽管超过80%的女性会在一生中感染HPV，但只有不到2%的人会患宫颈癌。

除了HPV外，沙眼衣原体也是宫颈感染的常见病原体。

沙眼衣原体与侵袭性宫颈癌和卵巢癌患者中HPV感染的发生率增加有关。

一些研究者认为，衣原体感染可能改变患者的免疫力，使其容易感染HPV，从而容易进展为宫颈癌，但合并感染的动力学和潜在机制尚不清楚。

在Hans Clevers团队开发出第一个宫颈癌类器官模型[1]后，类器官在宫颈癌中的研究得到了进一步的重视和推广。

类器官在体外能很好地模拟体内器官的三维结构和功能。

与二维细胞系和纯小鼠模型相比，类脏器具有独特的优势，已广泛应用于功能组织诱导、疾病模型构建、药物筛选等研究。

022年2月24日，来自德国的Cindrilla Chumduri团队开发了一种模拟HPV和沙眼衣原体共同感染的宫颈癌类器官模型，并阐明了宿主细胞独特的转录和翻译后重编程机制，揭示了宫颈癌的发生和发展机制。

这项题为“Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming”的工作最近发表在《Nature Communications》杂志上[2]。

HPV E6E7是指人类乳头瘤病毒的两个基因E6和E7，均为早期转录基因，常用于检测是否存在HPV感染和感染的严重程度。

HPV E6E7基因是阳性的，这意味着HPV病毒被感染，病毒DNA被整合到细胞DNA中，同时蛋白被表达。

为了系统评估HPV16 E6E7整合和随后与沙眼衣原体合并感染对宿主调节的影响，我们从健康志愿者中分离出宫颈外干细胞，嵌入到Matrigel中培养3D类器官，并从各种HPV类型的E6E7基因中进行测试。

三名捐赠者的宫颈外部器官检测HPV E6E7癌基因呈阴性。这些来自健康供体的HPV E6E7阴性的类器官被用来研究HPV整合对健康宫颈组织的影响。

随后，研究人员将携带HPV16 E6E7癌基因的慢病毒转染hCEcto(人子宫颈上皮干细胞)，将E6E7整合到宿主细胞基因组中。

研究发现，将HPV16 E6E7整合到外颈类器官中，可诱导宫颈异常增生(CIN，被认为是癌前病变)的表型特征。

因此，该宫颈类器官模型的构建为HPV及其合并感染的生物学研究开辟了一条新途径。

沙眼衣原体与HPV合并感染引起独特的转录反应

为了探讨宫颈沙眼衣原体与HPV合并感染的影响及相互作用，在上述HPV类器官模型的基础上，研究人员构建了沙眼衣原体合并感染的类器官模型。

结果表明，HPV E6E7的表达干扰了沙眼衣原体的正常发育，且在单次感染和合并感染中均可诱导沙眼衣原体的增殖信号。

接下来，研究人员进行了转录组分析，以确定沙眼衣原体、HPV E6E7单感染和联合感染对细胞信号传导的影响。结果发现，hCEcto E6E7细胞与沙眼衣原体共感染后，其基因表达发生了独特的变化。

引人注目的是，在HPV E6E7上调的基因中，28%的表达水平恢复到与混合感染沙眼衣原体的对照组相似，或强烈下调。

其中，E2F家族成员是最突出的反调控转录因子。

HPV E6E7显著上调E2F靶基因，沙眼衣原体感染后E2F靶基因下调。目前尚不清楚沙眼衣原体介导的对HPV E6E7诱导的E2F靶标的抑制对宿主细胞和病原体有什么影响。

为了研究两种病原体对Rb-E2F1通路的调控，我们用沙眼衣原体感染hCEcto和hCEcto E6E7类器官，并进行qRT-PCR和免疫印迹分析。

结果表明，在HPV E6E7表达缺失的情况下，沙眼衣原体显著抑制E2F1和抑癌因子p53，而联合感染时TP53显著降低，E2F1和RB1转录本不显著。

与沙眼衣原体感染相比，HPV E6E7可上调TP53、E2F1和RB1基因表达。

无论HPV感染与否，感染沙眼衣原体的hCEcto细胞总Rb、pRb (S807/811)、E2F1和p53蛋白均减少。

然而，E6E7表达增加了E2F1蛋白水平，并诱导p53几乎完全降解，而对总Rb、pRb (S807/811)蛋白水平无显著影响。

因此，上述结果表明，HPV诱导E2F1的激活，而衣原体抑制E2F1的激活。p53在HPV感染后转录水平上调，衣原体感染后转录水平下调。HPV和衣原体联合感染可导致p53蛋白降解。

然后，研究人员通过对未感染、沙眼衣原体感染、E6E7表达和联合感染的hCEcto细胞进行GSEA分析，评估差异表达基因(DEGs)影响的生物学功能。

结果发现，HPV E6E7和沙眼衣原体均能显著上调肿瘤坏死因子(TNF)通路，促进宿主细胞干细胞分化，减少细胞分化。

值得一提的是，参与DNA复制和DNA损伤修复的通路包括碱基切除修复(BER)、错配修复(MMR)、核苷酸切除修复(NER)、范可尼贫血(Fanconi anemia, FA)、源重组(Source recombination, HR)和p53信号通路受两种病原体反向调控:HPV E6E7表达激活这些途径，而沙眼衣原体抑制它们。

沙眼衣原体感染抑制DNA错配修复途径

由于E2F转录因子家族(参与细胞增殖和生长阻滞的几个基因的重要调控因子)被沙眼衣原体和合并感染下调，研究人员进一步分析了E2F转录因子家族在衣原体感染细胞中的作用。

RB样、E2F4、各种外阴B类蛋白和二聚化伙伴（DP1）通过形成梦复合体介导基因抑制以促进静止。

细胞周期检查点基因表达的缺失破坏了DREAM复合体介导的调节，从而破坏了细胞周期的平衡，从静止切换到增殖，这在癌症中很常见。

我们的分析表明，许多DREAM复合体靶基因被衣原体下调，在合并感染中阻止静止并促进细胞增殖。

此外，参与DNA修复途径的基因属于E2F1靶基因，受衣原体和HPV的反调控。沙眼衣原体感染导致hpv诱导的MMR(错配修复)基因的抑制。

综上所述，衣原体可在转录和翻译后水平抑制MMR，并可进一步抑制HPV激活的MMR。

衣原体和HPV调节MMR通路的机制

最后，研究人员试图从机制上阐明衣原体和HPV如何调节MMR通路。

据文献报道，MMR基因受E2F转录因子调控。

在大多数人类肿瘤中，Rb-E2F和MDM2-p53通路之间存在广泛的串扰，这凸显了这些通路在调节重要细胞决策中的关键作用。

研究人员使用蛋白酶抑制剂MG-132和Lactacystin抑制细胞和衣原体蛋白酶CPAF32, Nutlin-3a抑制MDM2和p53之间的相互作用，以检测p53稳定对MMR基因表达和蛋白水平的影响。

结果表明，Nutlin-3a和MG-132处理可恢复沙眼衣原体感染后MMR基因的表达，并能抑制沙眼衣原体诱导的p53降解，而E2F1降解在所有处理条件下均降低。

值得注意的是，MMR蛋白MLH1和MSH6仅通过MG-132抑制蛋白酶体活性得以恢复。

这一结果表明，衣原体参与了p53无关的蛋白酶体降解，降低了E2F1和MMR蛋白的含量，恢复E2F1和p53蛋白可以挽救MMR基因的转录抑制。

为了进一步研究沙眼衣原体如何调节MMR通路在HPV E6E7合并感染中，Nutlin-3a, MG-132和Lactacystin处理hCEcto E6E7干细胞时，有无沙眼衣原体感染。

结果表明，各种处理条件均降低了沙眼衣原体的传染性。

这些结果表明，蛋白酶体降解是E2F介导的MMR基因转录的重要调控机制，降低了联合感染中p53、E2F和MMR蛋白的表达。

意义

超过80%的妇女在其一生中会感染HPV，但只有不到2%的妇女会发展成宫颈癌。宫颈癌患者常同时感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)和沙眼衣原体，因此科学家推测沙眼衣原体和HPV的联合感染是重要的，但其潜在机制尚不清楚。

病毒可以在肿瘤中留下可检测到的DNA片段，在90%以上的宫颈癌中可以检测到病毒DNA片段。但与病毒不同的是，衣原体在癌细胞中几乎没有可检测到的成分，所以它诱导癌变的确切机制很难阐明。

在这项研究中，研究人员开发了一种子宫颈癌类器官模型，该模型模拟了HPV和沙眼衣原体联合感染，并证明了HPV和沙眼衣原体联合感染会导致宿主独特的细胞重新编程。

该研究将衣原体感染与宫颈癌的发生发展联系起来，进一步揭示了宫颈癌的发生发展机制。

感染HPV和衣原体后，多个基因以不同方式上调或下调，影响宿主的免疫应答和DNA损伤修复。

总之，干细胞中两种病原体的联合感染可能会对细胞和基因组的稳定性产生不利影响，并促进肿瘤的进展。

这项研究还有两个关键意义:

1)建立宫颈类器官模型，研究分层上皮组织屏障与HPV16、E6E7和衣原体个体及联合感染动力学的相互作用。本研究中开发和使用的宫颈类器官被证明是研究上皮组织和病原体之间复杂相互作用和分析早期发病事件的分子后遗症的优秀体外模型。

2)系统揭示了HPV16、E6E7和沙眼衣原体对宿主细胞的影响，论证了多次或连续感染所造成的危害和致癌的分子机制，阐明了宫颈癌发生发展的机制。

https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(21)00118-1
https://www.nature.com/articles/s41467-022-28569-1

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