结果 人iPSCs衍生神经干细胞研究细胞不对称性 作为研究亚细胞成分对称或不对称遗传的实验模型,我们使用了从人类iPSCs中获得的稳定可扩展的NSC群体[图S1A和( 7)]. 在生长因子-成纤维细胞生长因子2(FGF2)和上皮生长因子(EGF)的存在下,这些细胞可在不改变其生长动力学或分化潜能的情况下扩增( 7, 8)这些神经干细胞的一个特征是在体外形成玫瑰花状结构。 图1A显示了本研究中应用的两个独立健康个体产生的两个细胞系的典型生长模式。 细胞产生的花环显示出顶端-基底极性,中心腔由紧密连接标记物闭锁带-1和极性因子蛋白激酶Cλ标记(图S1B)。 在生长因子的存在下,大多数细胞对NSC相关转录因子Sox2和中间丝巢蛋白呈阳性,只有少数细胞表达神经标志物,如人类神经元蛋白HuC/D或βIII微管蛋白(Tubb3)( 图1A)培养物的稳定增殖证明在这种条件下细胞分裂的模式基本上是对称的。 同样在这些扩张条件下出现的神经元的低百分比数量进一步表明了一小部分细胞的自发分化。 接下来,我们通过研究Sox2和HuC/D在1周内的时间进程来研究FGF2退出后的分化动力学。 在分析的7天内,细胞总数基本保持稳定(图S1C)。 3天后,我们观察到HuC/D略有增加 + 细胞(占细胞总数的14.0±1.2%)。 分化5天后,HuC/D的百分比 + 分化后7天神经元数量增加到18.1±1.6%,达到26.2±2.0%( 图1C)根据这些分化动力学推断,我们选择FGF2退出后的第3天作为时间点,在进一步的实验中研究亚细胞囊泡成分的对称和/或不对称遗传,因为这个时间点在培养物的细胞成分发生显著变化之前。
图1 人类神经干细胞在FGF2退出后趋于分化,伴随着有丝分裂过程中LAMP1不对称分离的增加。
( A )从两个健康对照细胞系(Ctrl#1和Ctrl#2)获得的具有代表性的亮场图像和玫瑰花结型神经干细胞的免疫染色,以检测NSC标记物(Sox2和Nestin)和神经元标记物(Tubb3和HuC/D)。 ( B 和 C )Sox2和HuC/D的免疫染色和NSCs数量的各自定量(Sox2 + )神经元(HuC/D + )FGF2从Ctrl#1-NSCs退出后7天( n =3,Bonferroni多重比较试验的双向方差分析,均值+SEM)。 ( D 和 E )LAMP1对称和非对称分离的代表图像 + 和CD63 + Ctrl#1-NSCs有丝分裂过程中的小泡。 黄线表示子细胞周围的ROI,由DAPI和phalloidin染色确定(也可参见图S1E)。 ( F 和 G )基于配对子细胞之间的和强度比(见图S1D)在有或没有FGF2的情况下对LAMP1和CD63不对称性进行量化( N =6张来自三个独立实验的封面纸 n =每份盖玻片42至58个细胞,Bonferroni多重比较试验的双向方差分析,平均值+扫描电镜)。 ( H )在Ctrl#1-NSCs不同有丝分裂期LAMP1与Notch1受体共配的代表性图像。 ( I )不对称指数的相关性 A 在Ctrl#1和Ctrl#2-NSCs中的灯1和槽口1。 点代表单个有丝分裂事件,线性回归显示。 比例尺,100μm(A和B)、10μm(D、E和H)、5μm[放大(H)]。 DNA用DAPI复染* P <0.05和*** P <0.001。 n、 不重要。 另请参见图S1。
溶酶体的不对称遗传与神经干细胞分化过程中Notch受体的不对称分布有关 然后我们寻找标记内溶酶体室不同组分的抗原分布,并量化其对称或不对称遗传。 为此,我们建立了一个不对称指数( A )根据有丝分裂末期成对子细胞的免疫荧光染色强度和计算(图S1D)。 根据DNA和肌动蛋白染色分别确定有丝分裂期和子细胞面积(图S1E),并且认为有丝分裂事件与 A >0.2。 与兄弟细胞相比,其中一个子细胞的总和强度高出50%。 我们发现,在一小部分分裂中,早期内切体标记物早期内切体抗原1(EEA1)和Rab5是不对称分离的,而晚期内切体(Rab7)则是不对称分离的 + )回收内体(Rab11 + )萨拉亚群 + 内体和自噬体(LC3 + )极不均匀分布(图S1F)。 在分析的大量有丝分裂事件中,由溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)和LAMP2标记的溶酶体以及以CD63标记的多囊体被不对称地分离到两个子细胞中( 图1,D和E,以及图S1F)。 这一结果在分析子细胞间分离的囊泡数量时得到了证实(图S1G)。 为了将这一观察结果与决定子细胞的命运联系起来,我们直接比较了增殖培养物(+FGF2)和分化培养物中LAMP1和CD63的不对称性( ? FGF2)。 我们发现非对称性LAMP1从26.53±2.84%和30.21±2.62%显著增加到Ctrl#1和Ctrl#2分别为38.05±3.92%和40.21±2.83%,而CD63的不对称分布百分比在FGF2退出后没有改变( 图1,F和G)这些结果表明LAMP1有定向分离 + 促分化条件下神经干细胞有丝分裂过程中的小泡。 在两个独立的神经干细胞系之间,不对称分裂细胞的比例似乎高度保守,这表明一个共同的潜在机制促进了从增殖性细胞分裂到神经源性细胞分裂的转变。
接下来我们对LAMP1中的细胞命运决定因素感兴趣 + 囊泡可以辨认出来。 Notch信号成分的不对称分离被描述为几种生物体神经干细胞不对称细胞分裂和细胞命运决定因素的介导者( 4, 6, 9, 10)因此我们研究了Notch1及其亚细胞分布。 使用不同抗体的Notch1染色导致具有泡状图案的Notch1分布,这与Notch1在其配体结合时通过内溶酶体运输进行处理的想法一致[图S1H和( 11– 13)]. 然后我们寻找Notch1和LAMP1的共定位,发现在有丝分裂周期的几个染色囊泡结构中有重叠(在中期、后期和末期进行了研究; 图1H).A Notch1与CD63同时出现 + 囊泡也可以检测到,但明显更小(图S2,A和B)。 Notch1受体在子细胞间的总体分布与LAMP1相似,并且显示Notch1受体与LAMP1在每个子细胞对中的分布呈正相关。 在Ctrl#1和Ctrl#2中分析的细胞分裂率分别为41.89%和31.58%,Notch1和LAMP1是由LAMP1不对称地共同继承的 高的 子细胞( 图1I)相反的子代细胞中没有发现具有不对称遗传的有丝分裂事件。 这种相关性让我们假设LAMP1的不对称性可能会影响细胞命运的决定,至少在一定程度上,是通过使Notch信号活动偏向其中一个子细胞。
配体结合的Notch1受体通过网格蛋白介导的内吞作用被内吞并运输到溶酶体 对Notch1和LAMP1在NSCs中的定位进行免疫细胞化学分析,提示LAMP1中存在受体 + 溶酶体。 为了进一步验证这一发现,亚细胞组分用蔗糖梯度离心分离( 14)当研究Notch1和LAMP1在梯度的不同部分中的存在时,两种抗原都以高度相似的模式被检测到,表明这两种抗原都存在于相同的亚细胞室中( 图2,A至C)与此相反,其他囊泡标记物在组分中显示出不同的轮廓。 CD63 + 粒子与萨拉 + 内质体亚群仍显示与Notch1受体部分重叠,但在低蔗糖组分中富集更为强烈,其中内质体标记物EEA1显著积累。 这表明,在我们的细胞系统中,Notch1受体不存在于(早期)内体中,而是向溶酶体运输。 值得注意的是,早老素1作为γ-分泌酶复合体的主要成分,其分布模式类似于Notch1和LAMP1,这可能表明蛋白酶复合体对Notch1的S3裂解发生在溶酶体中。
图2 在网格蛋白介导的内吞作用后,Notch1受体在溶酶体中积累。
( A )从Ctrl#1-NSCs中收集蔗糖梯度组分的代表性Western blot。 ( B 和 C )囊泡标志物(B)、Notch1受体和γ-分泌酶亚基prenilin1(C)沿蔗糖梯度的蛋白质定量[ n =3,平均值+SEM,作为参考,再次在(C)中对LAMP1的平均值。 ( D 和 E )用0.1%(v/v)二甲基亚砜(D)或50μM dynasore(E)处理1小时后,对Ctrl#2-NSCs的LAMP1和Notch1进行免疫染色。 ( F )dynasore治疗前后LAMP1和Notch1受体的Manders共现分析( N =来自三个独立实验的179个细胞,Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较试验,单个细胞的点盒图)。 ( G )CTB-AF555染色和N1ECD和网格蛋白免疫染色的Ctrl#2-NSCs的代表性图像。 比例尺,20μm(D、E和G)和5μm[放大(D)、(E)和(G)]。 用DAPI复染(D和E)*** P <0.001。
为了研究受体从细胞表面转运到溶酶体的机制,我们用dynamin抑制剂dynasore处理细胞,发现两种抗原的共定位性降低,Notch1-LAMP1共存的Manders系数显著降低( 图2,D至F)Notch1胞外结构域(N1ECD)与网格蛋白共定位,而与脂筏相关的霍乱毒素B亚单位(CTB)不共定位,表明Notch1受体的内化是由网格蛋白介导的( 图2G)这些实验共同说明了Notch1受体通过网格蛋白和动态蛋白介导的内吞作用和Notch1受体向LAMP1的转运 + 我们神经干细胞系统中的溶酶体。 为了解释Notch1向酸性溶酶体的内化和转运是否是在配体结合的基础上启动的,我们使用重组pHrodo标记的人类delta-like protein 1(DLL1)Notch配体并进行了内化分析。 在溶酶体的酸性环境中,pHrodo染料是荧光性的,加入标记配体后30min,第一个pHrodo信号变得明显,随着时间的推移逐渐增加,并且可以被dynasore完全阻断,再次表明这是一个动态蛋白驱动的过程( 图3A以及图S2C)。 pHrodo信号与LysoTracker染料的荧光信号共定位,指示溶酶体中的共定位( 图3A)基于共焦活体细胞成像的Kymographs不仅显示了DLL1 pHrodo的内部化,还显示了pHrodo的细胞内动力学 + LysoTracker公司 + 小泡。 ( 图3B)一些佛罗多 + 结构保留或变成LysoTracker ? ,这可能是由于LysoTracker只对高度酸化的溶酶体亚群染色,仅代表由LAMP1标记的所有囊泡的一个子组分(图S2D)。 为了确认配体与受体结合后的靶向内化,我们在DLL1治疗30分钟后进行免疫染色。 我们能够用Notch1染色法检测到DLL1的斑点共定位,这表明DLL1不是随机内化的,而是作为一种配体-受体复合物( 图3C)在DLL1处理60分钟时,识别出内在的DLL1缺口复合物在有丝分裂事件中与兄弟姐妹分离(图S2E)。 进一步的证据表明这些复合物被转移到溶酶体中,DLL1的共染色显示了这一点 + 缺口1 + 点状带灯1( 图3C).
图3 Notch内化是由配体结合触发的,而囊泡酸化是受体激活所必需的。
( A )从LysoTracker染色的Ctrl#2-NSCs的活体细胞成像的代表性帧开始,在时间点0添加DLL1 pHrodo。 LysoTracker-和pHrodo单阳性囊泡结构分别用红色箭头和绿色箭头表示,双阳性结构用黄色箭头表示。 ( B )Ctrl-NSCOTR2与MOCDLACH2共聚焦成像。 LysoTracker-和pHrodo单阳性囊泡结构分别用红色箭头和绿色箭头表示,双阳性结构用黄色箭头表示。 ( C )三个蛋白质的Ctrl-6S孵育30分钟后,用Ctrl-6NSCA标记3个蛋白质。 ( D 到 F )用0.1%(v/v)二甲基亚砜、20μM DAPT、100 nM BafA或200μM亮氨酸处理2小时后,对裂解的N1ICD、总Notch1和肌动蛋白进行Western blot和Ctrl#1-NSCs的定量分析( n =4,用Bonferroni多重比较试验进行单因素方差分析,平均值±SEM)。 ( G )Notch下游靶基因表达的折叠变化 赫斯1 , 赫斯5 ,和 嗨1 用0.1%(v/v)二甲基亚砜、20μM DAPT、100nm BafA或200μM亮氨酸处理Ctrl#2-NSC 2小时( n =3,用Bonferroni多重比较试验进行单因素方差分析,平均值±SEM)。 比例尺,20μm(A和C)、5μm[放大(C)]和10μm(B)。 时间刻度,hh:minmin:ss(A)* P <0.05。 另请参见图S2。
由于Notch1-DLL1复合物被转运到溶酶体中,γ-分泌酶亚基prenilin1和LAMP1在蔗糖梯度上的分布相似,我们询问Notch信号的激活是否依赖于内溶酶体内的酸化环境。 为了解决这个问题,我们用空泡型H治疗神经干细胞 + 腺苷三磷酸酶抑制剂bafilomycina1(BafA)防止内溶酶体酸化(图S2F)。 对Notch1的γ-分泌酶裂解产物Notch1胞内结构域(N1ICD)进行免疫印迹分析,发现N1ICD的数量显著减少,未清除的Notch1受体有轻微积累( 图3,D至F)用γ-分泌酶抑制剂DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酸]-s-苯甘氨酸丁酯)处理细胞显示出非常相似的效果,支持了Notch的激活裂解依赖于膀胱内pH值下降的观点, leupeptin(Leu)对溶酶体蛋白酶的抑制既没有改变Notch1受体水平,也没有改变N1ICD的数量( 图3,D至F).DAPT处理2小时也会导致LAMP1内Notch受体的积累 + 小泡(图S2G),表明防止γ-分泌酶裂解增加了LAMP1中未清除的缺口1 + 小泡。 信号通路的激活通过靶基因的转录激活进一步分析, 赫斯1 , 赫斯5 ,和 嗨1 与蛋白质水平上的结果一致,经DAPT或BafA处理的NSCs,Notch靶基因的表达明显降低,且与DAPT或BafA处理的NSCs相似( 图3G)这些数据表明,在我们的NSC系统中,Notch受体的内化依赖于配体结合,而受体的活化蛋白水解裂解依赖于内溶酶体中的酸化环境。
不对称LysoTracker分离与HES1表达增加有关 我们目前的数据显示 + 囊泡通过分裂神经干细胞而非对称地遗传,也将Notch1与γ-分泌酶成分不对称地分离,从而通过释放Notch-ICD激活Notch信号。 为了研究溶酶体不对称分布后产生的子细胞是否显示Notch活性的差异,我们通过在Notch靶基因的内源性位点中引入td番茄荧光团的修饰序列来构建Notch信号报告细胞系 赫斯1 使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑( 图4A). 赫斯1 通过T2A序列与富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)(NLS-PEST)-TD番茄核定位序列相连,以确保HES1蛋白功能不受干扰。 生成的HES1(Hes家族bHLH转录因子1)报告系表达多潜能标记Oct3/4、Sox2和阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)(图S3A)。 通过Sanger测序(图S3B)验证了构建体的无疤痕整合。 靶向iPSCs产生的NSCs在形态和标记表达上与野生型NSCs相似( 图4B)如预期,iPSCs不显示Notch信号活性,因此没有td番茄表达,而其衍生的NSCs则显示高水平的HES1驱动的td番茄表达( 图4C以及图S3C)。 用Notch信号抑制剂DAPT处理神经干细胞后,通过培养物的形态学变化可以看到强迫的神经元分化,伴随着HES1报告信号的下调(图S3D)。 通过环己酰亚胺抑制蛋白质合成被用于测量HES1报告者的半衰期,该半衰期约为3.2小时(图S3E)。 HES1报告系的灵敏度足以监测DAPT处理对Notch信号的抑制或BafA对囊泡酸化的抑制( 图4,D和E)与此相反,在研究N1ICD蛋白水平时,抑制溶酶体蛋白酶活性并没有改变HES1报告信号( 图4,D和E).
图4 .HES1报告者追踪神经干细胞的Notch信号活动。
( A )CRISPR-Cas9介导的使用Ctrl#2-iPSCs生成HES1报告细胞系的靶向策略(特性参见图S3)。 ( B )对HES1报告神经干细胞的神经干细胞(Nestin和Sox2)和神经元标志物(Tubb3和HuC/HuD)进行免疫染色。 ( C )CRISPR-Cas9编辑花环型神经干细胞的典型亮场图像,TD番茄表达表明激活的Notch信号。 ( D 和 E )用0.1%(v/v)二甲基亚砜、20μM DAPT、100 nM BafA或200μM Leu处理的HES1报告神经干细胞进行12小时的活性细胞成像和强度和量化( N =来自三个独立实验的27个细胞,Bonferroni多重比较试验的双向方差分析,平均值±SEM)。 还显示了DAPT和BafA处理的指数回归曲线以及DMSO和Leu的线性回归曲线。 比例尺,100μm(B和C)和50μm(D)。 在(B)中用DAPI复染细胞核。 时间刻度hh:minmin:ss* P <0.05。 另请参见图S3。
然后我们使用HES1报告细胞系来监测子细胞中Notch活性,这是由于细胞分裂时酸性囊泡的对称和不对称分离造成的。 为此,我们监测了LysoTracker染色的HES1报告神经干细胞的单个有丝分裂事件,并在末期定量分析了LysoTracker信号( 图5A)根据亮场图像和td番茄信号对分裂细胞和各自的子细胞进行识别。 此外,溶酶体分布的不对称性被定义为类似于用指数进行免疫染色的LAMP1不对称性 A >0.2。 共鉴定了124个对称和31个不对称有丝分裂事件,并进一步分析了HES1报告者在配对子细胞中的表达( 图5B)在有丝分裂后,由于有丝分裂过程中TD番茄蛋白的遗传相同,两个兄弟姐妹显示出相似的荧光强度。 从有丝分裂事件后15分钟开始的时间推移记录表明,在接下来的几个小时内,报告者的不对称性被建立(在所描绘的例子中,由于接收较少溶酶体的子细胞的强度降低;电影S1)。 因此,由于报告者的半衰期约为3小时(图S3E),在LysoTracker量化90分钟后开始量化td番茄荧光动力学,并在细胞分裂时间点后跟踪子细胞6小时( 图5C)子细胞间HES1表达的差异表明,由于LysoTracker不对称的细胞分裂,HES1表达有明显的偏向性( 图5D以及图S3F)。 由于数据内部差异很大,这一趋势并不显著。 因此,为了更详细地了解HES1的表达动态,将TD番茄模式按其欧氏距离分为四类[ 图5、E和F,和( 15)]:(i)对称HES1表达式; (ii)HES1的不对称表达,与终末期的LysoTracker分布相反; 在接受细胞分裂时,hesotracker(iii)和(iii)对细胞分裂有轻微的不对称性。 当比较显示对称LysoTracker分布的HES1报告者不对称性与那些显示不对称LysoTracker分布的分区的不对称性时,我们观察到对称和轻微不对称的HES1驱动的报告者活动的百分比只发生微小的变化(分别为46.0%和41.9%和22.6%对22.6%)( 图5G)我们观察到,史塔克的非对称性增加了25.1%,与之形成强烈对比。 同时,报告者表达不对称的分裂比例也出现了两半(19.7%对9.7%)。 这些数据支持这样一个假设:配对子细胞中Notch信号活性的偏差部分是由溶酶体小泡的定向穿梭介导的。
图5 溶酶体不对称性与神经干细胞来源的HES1差异表达有关。
( A )用LysoTracker染色的有丝分裂HES1报告NSC的活细胞成像的代表性时间帧。 根据LysoTracker强度和的定量,子细胞1被定义为有丝分裂末期(时间点0)接收到更多LysoTracker信号的细胞。 ( B )LysoTracker对称和不对称细胞分裂的分布( n =10个独立实验)。 ( C )有丝分裂后1.5至6小时,子细胞1和2中TD番茄信号的代表性时间帧。 ( D )差异 z -LysoTracker对称和不对称分裂子细胞1和2的归一化强度和( N =124/31,对于10个独立实验的对称/不对称细胞分裂,平均值+扫描电镜)。 ( E )HES1在子细胞对中表达动力学的热图和聚类分为四组:(i)对称的,(ii)相反的不对称的,(iii)轻微的和(iv)高度不对称的。 ( F )番茄不同群体荧光强度的动态变化( N =70、27、35和23,对于第1组到第4组,来自10个独立实验,平均值为±SEM)。 ( G )HES1报告神经干细胞分裂过程中LysoTracker对称和非对称遗传后HES1的表达动态和聚集频率( N =124/31的对称/不对称细胞分裂来自10个独立实验)。 20μm(A和C)。 时间刻度hh:minmin:ss(A和C)。 另请参见图S3。
溶酶体和Notch1的不对称分离与前脑器质细胞分裂有关 到目前为止,我们的数据表明Notch活性在分化NSCs的子代时是不对称遗传的,部分原因是含有酸性溶酶体的Notch1的不对称遗传。 这一观察结果产生的一个主要问题是,这种分裂产生的子细胞是否具有不同的细胞特性。 因此,我们开始研究人类大脑类器官的细胞分裂。 人们一致认为,在类器官系统中,可以通过分裂细胞相对于皮质环顶端腔的位置来区分对称和不对称分裂( 16, 17)第20天前脑类器质由几个由Sox2组成的皮质环组成 + 沿着心室样结构的祖细胞( 图6A).我们用鬼臼蛋白和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色鉴定心室内膜有丝分裂细胞,并将其定义为平面分裂、分层分裂或中间分裂( 图6、B和C)我们在三批分析的类器官中发现了55.9±2.8%的平面型、22.8±5.4%的中间型和21.3±6.0%的分层有丝分裂事件( 图6D)平面细胞分裂中LAMP1和Notch1分布的定量显示大部分为对称分离,其平均不对称指数为0.004±0.014 ? 分别为0.012±0.015( 图6,C和E)中间细胞分裂已经显示出更不对称的分布趋势,并且分层细胞分裂的不对称指数显著增加,LAMP1和Notch1的不对称指数分别为0.130±0.036和0.098±0.031( 图6E)这将LAMP1和Notch1的不对称性以及随后出现的Notch信号活动偏差与发育中的人类皮层模型系统中神经源性细胞分裂有关。 附着在根尖膜上的神经干细胞接受更多的溶酶体,因此具有更高的Notch活性,保持其干细胞特性,而从根尖膜分层的细胞则被激活的Notch信号所耗尽,并可能在有丝分裂后进行神经元分化。
图6 前脑器质细胞分裂显示LAMP1和Notch1在心尖子细胞中有偏定位。
( A )20天大的前脑类器质免疫染色的代表性图像,NSC标记物Sox2和神经元标记物Tubb3,皮质环用白色虚线表示。 ( B )前脑类器质的图示,皮质环和神经干细胞在环的顶端膜以平面、中间或分层的方式分裂。 ( C )前脑类器官的免疫组化染色,包括鬼臼蛋白、LAMP1和Notch1。 在顶端膜(黄色虚线)分裂的细胞被指南针染色,并分为平面的,中间的,或分层的细胞分裂。 显示ROI(黄色)区域内的LAMP1和Notch1信号。 ( D )(B)中定义的细胞分裂模式分布( n =3个独立实验,平均值+扫描电镜)。 ( E )基于成对子细胞之间的和强度比(另请参见图S1)对LAMP1和Notch1不对称性进行量化( N =60/28/19来自三个独立实验的平面/中间/分层细胞分裂,Kruskal-Wallis试验和Dunn的多重比较试验,单个有丝分裂事件的点盒图)。 比例尺,300μm(A)和5μm(C)。 在(A)中用DAPI复染细胞核** P <0.01。
讨论 内溶酶体途径的囊泡成分在有丝分裂过程中是不对称遗传的( 三– 5).在SOP中 D、 黑腹菌 斑马鱼神经管的脊髓前体细胞(Sara标记的内分体的一个子集)被显示为向该同胞传递Notch受体和Notch配体,后者继续增殖,这表明Notch组分的这种偏差与维持干细胞/祖细胞特性有关( 4, 5)然而,在这些模型生物体中,囊泡转运的机理基础已经相当清楚,并且依赖于细胞内极性和沿极化微管的转运( 4– 6, 18, 19)电位Notch激活的机制尚不清楚。 最近,在哺乳动物的造血谱系中,溶酶体和降解机制的其他组成部分的不对称遗传被证明可以预测接收细胞的代谢状态和产生的细胞多样性( 三)在这项研究中,Notch通路的组成部分被证明是共隔离的,尽管Notch活性的影响没有进一步讨论。
在我们的研究中,我们证明溶酶体在人神经干细胞中不对称分离,并且这些溶酶体含有配体结合的Notch受体。 我们发现,当重组配体结合后,配体-受体复合物通过内吞途径进入溶酶体,并且γ-分泌酶复合物的组分在相同的亚细胞组分中以密度梯度分离。 这与已发表的γ-分泌酶亚细胞定位研究一致( 20, 21)我们的研究发现,溶酶体酸化的抑制在生物学上类似于特异性γ-分泌酶抑制。 这些数据表明Notch裂解与溶酶体室的酸性环境之间存在联系,这表明了先前尚未确定的机制,即囊泡受体同胞细胞在分裂后如何偏离Notch活性水平。 因此,我们更进一步,通过结合非对称溶酶体遗传的活细胞检测和我们通过基因靶向生成的Notch报告细胞系来测定接收细胞中的Notch活性。 这些实验表明,NSCs分裂过程中溶酶体的不对称性与子细胞的Notch活性偏差有关。
我们的实验环境不允许长期跟踪兄弟姐妹及其后代,也不允许产生血统关系。 由此,我们不能断定溶酶体和Notch受体细胞保持着更具增殖性的类似干细胞的命运。 然而,强调这一假设的是我们在人脑类器官中所做的观察。 人们一致认为,细胞分裂的平面和与心尖膜的附着程度可以预测子细胞的细胞命运,也就是说,离开心室区域且与心尖膜接触较少的细胞易于分化, 而附着在根尖膜上的细胞仍然是干细胞( 16, 17, 22, 23)在我们的实验中,这些贴膜细胞接受了更多的溶酶体和更多的Notch受体,这符合上述假设。 萨拉人 + 在我们的神经干细胞系统中,内体没有表现出不对称遗传的趋势。 这表明脊椎动物的造血系统与低等脊椎动物的细胞遗传有偏差。 值得注意的是,我们没有讨论接受细胞的代谢状态,因为在造血系统中进行的研究没有涉及Notch活性( 三)推测两种干细胞在遗传上的相似性是很明显的。 因此,研究其他干细胞和祖细胞群体以及其他物种,以确定溶酶体是否和何时成为人类干细胞和祖细胞中的中心信号中枢,以及是否、何时和为什么这可能从内体转移到酸性更强的溶酶体。
材料和方法 伦理声明 本研究中使用的iPSCs来自健康捐赠者。 捐赠者给予书面知情同意。 所有人类材料的实验都符合赫尔辛基宣言。
一般细胞培养 所有细胞在5%和37°C下培养,加入1:100青霉素链霉素(Invitrogen,15140122),并通过聚合酶链反应(PCR)定期检测支原体。 除非另有说明,细胞培养板在使用前涂上1:100盖特瑞克斯(Invitrogen,A1413302)。 在实验室中制备氮气补充剂如下:杜尔贝科改良鹰氏培养基(DMEM)/F12(Invitrogen,11320074)、胰岛素(500μg/ml)(Sigma-Aldrich,91077C)、转铁蛋白(10 mg/ml)(Sigma-Aldrich T3705)、亚硒酸钠(520 ng/ml)(Sigma-Aldrich,A8960)、腐胺(1.611 mg/ml)(Sigma-Aldrich 51799), 黄体酮(630ng/ml)(西格玛·奥尔德里奇,P8783)。 有关不同单元类型及其维护的更多详细信息,请参见以下部分。
IPSC文化 用仙台病毒对两名健康成人供者(ctrl#1:男性,活检年龄:33;ctrl#2:女性,活检年龄:44)的皮肤成纤维细胞重编程。 在E8培养基中,在无饲养条件下,在Geltrex涂层板上维持IPSC:DMEM/F12,Hepes(Invitrogen,11330057),亚硒酸钠(14ng/ml)(Sigma-Aldrich,A8960), 我 -抗坏血酸磷酸酯(64μg/ml)(Sigma-Aldrich,A8960)、胰岛素(20μg/ml)(Sigma-Aldrich,91077C)、转铁蛋白(11μg/ml)(Sigma-Aldrich,T3705)、FGF2(100 ng/ml)(细胞引导系统,GFH146)和转化生长因子β(2 ng/ml)(细胞引导系统,GFH39)。 媒介是每天变化。 使用EDTA(Invitrogen,15575020)进行分离,并将5μM Y-27632(细胞引导系统,SM02)添加到培养基中24小时。
神经干细胞的神经诱导与培养 用Smad和Wnt双重抑制诱导iPSCs的神经命运。 因此,将融合的iPSC培养基改为含有200 nM LDN193189、500 nM A83和2μM XAV 939的神经诱导培养基,在DMEM/F12(Invitrogen,11320074)、0.5%N2(自制,见上文)、1%B27(Invitrogen,17504044)、1%谷氨酰胺(Invitrogen,35050038)、1%非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen,11140035), 4.44 mM葡萄糖(Roth HN06.2)。 每天更换培养基,10天后用胰蛋白酶进行低密度分裂。 为了进一步维护,细胞保存在含有3μM CHR99021和500 nM嘌呤胺的DMEM/F12培养基中(Invitrogen,11320074),补充0.5%N2(自制,见上文)、0.5%B27(Invitrogen,17504044)、1:100谷氨酰胺(Invitrogen,25030024)和4.44 mM葡萄糖(Roth HN06.2)的DMEM/F12培养基中。 介质每天更换,周末每隔一天更换一次。 使用胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen,15400054)和胰蛋白酶抑制剂(Invitrogen,17075029)传代细胞。
实验前,将培养基切换到DMEM/F12(Invitrogen,11320074),0.5%N2(自制,见上文),1%B27(Invitrogen,17504044),8.88 mM葡萄糖(Roth HN06.2),EGF(10 ng/μl)(细胞引导系统,GFH26), FGF2(10ng/μl)(细胞引导系统,GFH28)诱导SM-NPCs向花环型NSCs的转化至少3天。 对于不对称定量,神经干细胞保持在EGF/FGF2条件下,直到第一次自发分化发生,分裂成最终形式,并在有或没有FGF2的情况下培养3天。
皮质前脑型器质生成 如前所述,经过小幅度调整后生成类有机物( 24)简单地说,低附着性U型底部96孔板涂有5%的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。 用胰蛋白酶表达分离iPSCs(Invitrogen,12605028),并将6000个细胞接种在添加50μM Y-27632(细胞引导系统,SM02)的E8培养基中。 每隔一天更换一次介质。 在第5天,将培养基改为类器官诱导培养基:DMEM/F12(Invitrogen,11320074)、0.5%N2(自制,见上文)、1%B27(Invitrogen,17504044)、1%谷氨酰胺(Invitrogen,35050038)、1%NEAA(Invitrogen,11140035)、4.44 mM葡萄糖(Roth HN06.2)、肝素(10μg/ml)(Sigma-Aldrich,H3149)、胰岛素(100 ng/ml)(Sigma-Aldrich,91077C), 50μMβ-巯基乙醇(Invitrogen,31350010)、200 nM LDN193189、500 nM A83和2μM XAV 939。 每隔一天更换一次介质。 第10天,将类器官包埋在凝胶剂:培养基的3:2混合物中,根据( 25)此后,将LDN193189、A83和XAV 939从培养基中取出,将类有机物培养在6厘米厚的Pluronic培养皿中,培养基每3至4天更换一次。 在胚状体形成后第20天分析类器官。
分子克隆与核感染 对于HES1报告系的产生,同源臂与DNA序列相对应 赫斯1 从基因组DNA中扩增出终止密码子周围的基因,并用经典的分子克隆方法克隆到pBluescript主干(Addgene,#72835)。 这个 T2A型 在帧中添加序列(gaggggaggaaggagtcttctaacatgcgtgacgtgaggagaatcccgcccct),然后 番茄 还有一个 NLS-害虫 顺序。 各自的序列是从Cytbow vector(来自Livet实验室的礼物)中扩增出来的,发表于( 26)]来自HES5报告者vector(恩里克实验室的礼物,发表于( 27)]分别是。 用于扩增的引物是从综合DNA技术公司订购的: 赫斯1 5′同源臂,(5′-cgtgattcctgggggtcatggtttag-3′和5′-gttggcgcgcgcgctgtcgtgacgtccgcgcgcgcgcgctc-3′), 赫斯1 3′同源臂, 番茄 (5′-tgcaccggtatggtgagcaagcaaggg-3′和5′-acggagtcgtaacgcgtgtacgctcgtccatg-3′),以及 NLS-害虫 (5′-tgcacgcgtcctccaaaaagagagagaaag-3′和5′-tcggagctcctaccatattgatcctagcag-3′)。 对于指导RNA,以前发表的序列是针对最后一个外显子 赫斯1 ( 28)寡核苷酸从集成DNA技术公司购买并克隆到pSpCas9(BB)-2A Puro(PX459)v2中。 0(Addgene,#62988)遵循分销商协议。
根据制造商的协议,使用核受体2b和细胞系核受体试剂盒V(Lonza,VCA-1003)对iPSCs进行核感染。 简单地说,Ctrl#2-IPSC用胰蛋白酶表达(Invitrogen,12605028)处理并计数,106个细胞在300℃离心 g 5分钟。将颗粒重新悬浮在82μl核子受体溶液V、18μl补充1和1μg每个质粒中。 用于核感染的程序是B-027。 细胞在不含青霉素链霉素的E8培养基和5μM Y-27632(细胞引导系统,SM02)中培养。 核感染后1天,向培养基中加入嘌呤霉素(0.33μg/ml)(EMD微孔,#540222)。 24小时后,将培养基换成含青霉素链霉素、嘌呤霉素和Y-27632的E8培养基。 分别于感染后274天和634天从培养基中取出核仁。 当菌落达到合适的大小后,人工将克隆体放入48孔平板中。 克隆经基因分型和测序证实。
免疫荧光染色 免疫荧光染色时,将神经干细胞分裂到玻璃盖玻片上,玻片经盐酸预处理后涂以聚乳酸- 我 -赖氨酸(PLL)(100μg/ml;Sigma-Aldrich,P2636)溶于25 mM硼酸(pH 8.4)和层粘连蛋白(2.5μg/ml)(Invitrogen,23017015)。 为了标记脂质筏,在固定前用CTB(10μg/ml)在4℃下处理1小时。 细胞在4%多聚甲醛(PFA)中固定10min,PBS洗涤,PFA反应在PBS中25mm甘氨酸中猝灭10min。 在PBS中再次洗涤后,用0.1%皂甙或0.3%Triton X-100的10%胎牛血清(Invitrogen,10270106)阻断和渗透1小时。 主要抗体在4°C的封闭溶液中培养过夜。以下主要抗体用于Triton X-100渗透性:HuC/D(1:500;Thermo Fisher Scientific,A-21271)、Sox2(1:500;细胞信号技术,3579)、Tubb3(1:1000;突触系统,302 304)、Nestin(1:600;研发系统,MAB-1259), 2014年10月3日(1:600;圣克鲁斯生物技术公司,sc5279), 和SSEA4[1:600;发育研究杂交瘤库(DSHB),MC-813-70)。皂甙渗透用于以下主要抗体:LAMP1(1:400;DSHB,H4A3)、CD63(1:400;ExBio-Praha,11-343-C100)、EEA1(1:100;细胞信号技术,48453)、LC3(1:100;细胞信号技术,12741)、Rab5 (1:100;细胞信号技术,46449)、Rab7(1:100;细胞信号技术,9367)、Rab11(1:100;细胞信号技术,5589)、Sara/ZFYVE9(1:100;Sigma-Aldrich,HPA065852)、Notch1(1:200;细胞信号技术,4380)、Notch1(1:100,DSHB bTAN 20-c)、Notch1ECD(1:50;BioLegend,819101); Notch2(1:400;细胞信号技术,4530),他的标签(1:500;Biotrend,CHIS-45A-Z)。 Notch1ECD的细胞外染色没有渗透性(1:50;BioLegend,819101)。 盖玻片用PBS或皂甙封闭液洗涤三次,每次10min。 在相应的封闭溶液中稀释二级抗体,并在室温(RT)(1:1000;全部为Invitrogen)下施加1小时。 在适当的情况下,向混合物中添加ATTO 565 phalloidin(1:2000;ATTO-Tec AD,565-81)。 在PBS中洗涤两步10min后,在室温下用300nmdapi复染10min。在PBS和水中两次短暂洗涤后,将盖玻片装入Mowiol。
在EB生成后的第20天,在4%PFA中于RT条件下固定10分钟,在PBS中洗涤三次,然后转移到PBS中的30%蔗糖中,在4℃下脱水过夜。在将10%(w/v)蔗糖和7.5%(w/v)明胶包埋在PBS中后,在冷冻恒温器中切取20μm厚的切片,保存在 ? 20°C。解冻有机物切片后,按照上述方案使用0.3%Triton X-100渗透性对其进行处理。
不对称量化 对细胞分裂过程中的不对称蛋白分离进行定量分析 z -叠加单个有丝分裂事件的图像。 因此,使用配备有DFC9000 GT相机和HC PL APO 40×/0.95干法物镜(全徕卡)的徕卡DM6 B显微镜对NSC的二维培养进行成像。 用HCX-PL-apo63×/1.40-0.60油镜(均为徕卡)在TCS-SP5-II共焦激光扫描显微镜上成像。 Z -堆叠 z 2D和3D培养分别获得0.29和0.5μm的增量。 根据DAPI和phalloidin信号设置子细胞的感兴趣区域(roi),并通过和强度投影测量每个子细胞的平均信号强度 z -堆叠。 根据二次抗体对照染色法减去背景值,然后用平均信号强度乘以细胞面积计算单个子细胞的强度和。 不对称指数 A 计算如下
A = 强度 ? ∑ ? 细胞 ? 1 ? 强度 ? ∑ ? 细胞 ? 2 强度 ? ∑ ? 细胞 ? 1 + 强度 ? ∑ ? 细胞 ? 2
2D时,LAMP1/CD63信号强度之和较高的子细胞设为1细胞。 因此,不对称指数的范围从0(表示完全对称)到1(表示完全不对称的蛋白质分布)。 Notch1的不对称指数范围为 ? 1到1,其中正值表示与LAMP1在同一细胞中的分离,负值表示与相反子细胞的分离。 在3D中,细胞1被定义为根尖较多的子细胞。 在平面细胞分裂中,细胞1和2的分配是随机的。 为了分析囊泡数的不对称分离,ComDet v0。 4.1 ImageJ插件( 29)并用类似于上述公式计算不对称指数。
配体内化 对于活细胞配体内化,重组DLL1-6xHis(研发系统,1818-DL-050)根据制造商的协议用pHrodo iFL Green(Thermo Fisher Scientific,P36015)标记。 简单地说,将50μg重组蛋白重新悬浮在100μl ddH中 2 O、 并添加10μl 1 M碳酸氢钠。 添加6.1μl 2 mM pHrodo溶液后,将混合物在RT下孵育15分钟,并使用所提供的柱纯化标记蛋白。 神经干细胞生长在PLL层粘连蛋白包被的ibidi板上(涂层见“免疫荧光染色”一节)。 成像前,将细胞在成像缓冲液中平衡30分钟【140 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM Hepes和10 mM葡萄糖(pH 7.4)】。平衡期间,向缓冲液中添加0.1 nM LysoTracker深红色、50μM dynasore或0.1%(v/v)二甲基亚砜(DMSO)。 然后,将佛罗多标记的DLL1-6xHis以1:5的比例直接加入到显像缓冲液中,在加入配体后5min开始成像。 细胞内部化用配备Axiocam 506(均为卡尔蔡司)的CellDiscoveryer 7显微镜成像,细胞保持在37°C和5%CO 2 在整个图像采集过程中。 采用平面无色差50×/1.2水自动校正物镜(卡尔蔡司),一台7μm z -添加DLL1后,每隔2.5分钟至1小时,以0.5μm的增量进行堆垛。 对于kymographs,使用TCS SP5 II显微镜和63×/1.40油物镜(徕卡)进行额外的共焦活体细胞成像,成像过程中物镜表保持在37°C,在加入标记配体后,每10秒对细胞成像1小时。
对于免疫染色,将人重组DLL1-6xHis(Sino Biological,11635-H08H)稀释至10μg/ml的培养基中,并添加到盖玻片上生长的神经干细胞中(关于涂层,请参见“免疫荧光染色”一节)。 细胞在37°C和5%CO下进一步培养30分钟 2 使配体内部化。 为了去除残留在细胞表面的配体,然后用冰醋酸缓冲液【200mm醋酸和500mm NaCl(pH 2.0)】在冰上冲洗5 min。 细胞固定在4%PFA中,进行免疫荧光处理。 用HCX-PL-apo63×/1.40-0.60油物镜(均为徕卡)在TCS-SP5-II共焦激光扫描显微镜上获得具有代表性的图像。
曼德斯共现分析 为了分析受体内吞作用,神经干细胞在固定前用50μM dynasore或0.1%(v/v)二甲基亚砜处理1小时,并进行免疫荧光染色(见上文)。 Z -用leicadm6b显微镜和DFC9000-GT相机和HC-PL-apo40×/0.95干法物镜(全徕卡)获得0.29μm的堆积体。 在Leica applicationsuitex软件(leicaapplicationsuitex)中实现的小体积计算清除算法降低了背景荧光。 这项分析是针对每种情况和使用ImageJ插件EzColocalization在10张图像上对总共60个细胞的最大强度投影进行分析( 30)。LAMP1和Notch1的阈值分别基于前10%和20%的像素设置。 roi被手动设置在细胞的细胞质周围,不包括分析的细胞核。 三个独立实验的结果被汇集在一起。
HES1记者稳定性 为了测定TD番茄的半衰期,用100μM环己酰亚胺处理HES1报告神经干细胞。 在加入环己酰亚胺后直接开始成像,每隔10分钟观察10小时。为了分析溶酶体酸化对Notch信号的影响,将来自HES1报告系的NSCs与野生型Ctrl#2-NSCs以1:10的比例混合。 在开始成像之前,直接加入0.1%DMSO、20μM DAPT、100 nM BafA或200μM Leu。 每12小时追踪一次细胞。
对于这两个实验,使用了带有Axiocam 506的CellDiscoveryer 7显微镜和一个平面无染色质20×/0.7自动校正物镜(全卡尔蔡司),并将细胞保持在37°C和5%CO 2 对每个核的背景进行人工和强度分析。 在棱镜6(GraphPad)上计算指数拟合曲线。
追踪有丝分裂事件和各自的子细胞 为了显示溶酶体不对称性并跟踪子细胞中HES1的表达,HES1报告型NSCs与野生型Ctrl 2-NSCs以1:10混合,并接种在PLL层粘连蛋白涂层的3.5 cm ibidi培养皿上。 细胞培养3天,在实验当天用75nm诺可达唑使细胞同步化。 4小时后,广泛冲洗细胞,并加入含有0.1nm LysoTracker深红色的新鲜培养基。 清洗30分钟后,使用配备Axiocam 506的CellDiscoveryer 7显微镜开始活体细胞成像。 在最初的1.5小时内,用平面无染色质50×/1.2水自动校正物镜(Carl Zeiss)对有丝分裂事件进行成像,每200秒成像7μm z -以0.5μm的增量堆叠。 随后,用20×0.95自动校正仪(Carl-Zeiss)对子代细胞进行了为期14小时、帧间10min的跟踪。
活细胞成像期间的LysoTracker信号被视为免疫染色的总强度值,据此计算不对称指数,并将cell1定义为具有较高LysoTracker信号的子细胞(另见不对称量化部分)。 HES1的表达被追踪为TD番茄信号的强度,其量化如HES1报告者稳定性一章所述。 此外,TD番茄的强度为 z -在每个实验中,通过将cell2的第一个时间点设置为0对单个时间序列进行归一化,并根据它们的百分比秩重新调整归一化数据。 根据每个时间点的标准化和排序数据以及原始数据,使用以下公式计算子细胞对内荧光强度的差异
强度 ? ∑ ? 细胞 ? 1 ( t ) ? 强度 ? ∑ ? 细胞 ? 2 ( t ) 强度 ? ∑ ? 细胞 ? 2 ( t )
所有这些分析都是在Excel(Microsoft)中进行的。 在聚类方面,使用RStudio中的time-courseinspector包将两个子单元的时间序列连接起来并进行分析( 15)聚类是基于完整时间序列的欧几里德距离。 通过目测每个聚类的平均值,将聚类数设为6。 簇被分组来表示对称、反对不对称、轻微不对称和高度不对称的HES1表达模式。
蔗糖梯度 如前所述,从2×10-cm培养皿中获取神经干细胞并用低张休克裂解( 14)简单地说,用0.5×蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific,A32955)在PBS中清洗细胞,从培养皿中刮出,在200℃下离心 g 5分钟。用低渗缓冲液[3 mM咪唑(pH 7.4)、1 mM EDTA和1×蛋白酶抑制剂]短暂洗涤小球,并在200℃下离心 g 并在4℃下保持10分钟。然后,将颗粒重新悬浮并在低张条件下在冰上保持15分钟。添加蔗糖缓冲液[500 mM蔗糖、3 mM咪唑(pH 7.4)、1 mM EDTA、0.06 mM环己酰亚胺和1×蛋白酶抑制剂],通过穿过22号针10次来裂解细胞。 在2000年用离心法将细胞核颗粒化 g 4℃处理10min,将核后上清液转移到10~50%的蔗糖梯度上。 细胞内囊泡在200000℃超速离心16h g 收集20个组分,每个组分500μl,用Western blot分析每个组分的40μl。
免疫印迹 对于缺口切割分析,在0.1%(v/v)二甲基亚砜(Sigma-Aldrich,D5879)、20μM DAPT(细胞引导系统,SM15)、100 nM BafA(VWR International,J61835.MX)或200μM Leu(SERVA电泳股份有限公司,51867.02)的存在下培养2小时; 用PBS清洗; 在放免沉淀试验缓冲液中[50 mM tris HCl(pH 7.4)、150 mM NaCl、0.2%Triton X-100、25 mM EDTA、0.2%十二烷基硫酸钠和1×蛋白酶抑制剂]在冰上裂解1小时。 使用20%占空比、50%输出和七个脉冲对样品进行超声处理,并在16000下离心 g 并在4℃下保持15分钟。上清液中的蛋白质浓度通过皮尔斯BCA蛋白质分析法测定(Thermo Fisher Scientific,23227)。
将20微克蛋白质裂解物或40μl蔗糖梯度分数稀释在6×蛋白质样品缓冲液中【375 mM tris(pH 6.8)、6%十二烷基硫酸钠、6%甘油、9%β-巯基乙醇和0.03%溴酚蓝】中,并在95°C下培养5分钟。在非还原条件下处理分析CD63的蔗糖梯度部分,即:。, 采用不含β-巯基乙醇的6倍缓冲液。 使用tris-tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在110V下分离2-3小时,并使用Trans-Blot TurboTM转移系统(Bio-Rad)在1a时转移到0.2-μm硝化纤维素膜上45分钟。用5%奶粉在tris缓冲盐水中用吐温(TBS-T)封闭1小时。 在封闭溶液中稀释主要抗体,并在4℃下培养过夜。在TBS-T中清洗膜三次,在TBS-T中RT培养1小时。用TBS-T再次清洗膜三次,并在奥德赛成像仪(Li-COR)上成像。 使用以下主要抗体:Notch1(1:1000;细胞信号技术,4380)、Notch1裂解(1:1000;细胞信号技术,4147)、早老素1(1:1000;BioLegend,823404)、EEA1(1:1000;细胞信号技术,3288)、Sara/ZFYVE9(1:1000;Sigma-Aldrich,HPA065852)、LAMP1(1:1000;细胞信号技术,9091), CD63(1:200;ExBio-Praha,11-343-C100)和肌动蛋白(1:10000;细胞信号技术,3700)。 使用的次级抗体是抗兔染料800、抗鼠染料680和抗鼠染料800(均为1:15000;全细胞信号技术,5151、5470和5257)。
通过剥离和重制对一层膜进行缺口劈裂分析。 用剥离缓冲液[25 mM甘氨酸(pH 2.0)]反复孵育5分钟和40分钟,去除Notch1裂解抗体。用TBS-T清洗剥离膜三次,从膜封闭开始用Notch1抗体重复染色程序。
使用ImageJ中的密度分析进行量化。 因此,在每个车道周围设置roi,并分析背景信号强度。 对于缺口劈裂的分析,劈开缺口1的信号被归一化为相应的总缺口1信号,总缺口1水平被归一化为肌动蛋白。 为了分析蔗糖梯度,将每个蛋白质的组分标准化为蛋白质含量最高的相应组分。 每个实验分析三到四个生物复制品。
实时PCR和qPCR 在PEQGOLD-TriFast(VWR)中收获nsc,并根据制造商的方案分离RNA。 简而言之,细胞裂解后加入氯仿,混合物在室温下培养15分钟,在12000下离心 g 5min使不同相分离,并向水相中添加异丙醇。 RNA在 ? 20°C,转速降到12000 g 在用75%乙醇洗涤两个步骤后15分钟,将RNA颗粒风干并在焦碳酸二乙酯处理过的水中再悬浮。 用脱氧核糖核酸酶I(Sigma-Aldrich,AMPD1)处理去除基因组DNA污染。 根据制造商的协议,使用iScript互补DNA(cDNA)合成试剂盒(Bio-Rad,1708891BUN)来生成cDNA。 用定量PCR(qPCR)定量检测10μM DAPT、100nm BafA或0.1%(v/v)DMSO处理2小时后NSCs中Notch靶基因的表达。 使用了以下引物(所有整合的DNA技术): 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′和5′-tgagggtcattggca-3′), 赫斯1 (5′-aaaaaa-ttcctcgtccggt-3′和5′-ggctttgactttctgtgct-3), 赫斯5 (5′-tgagcaagcagcaagctctc-3′和5′-gcagcacaggagtag-3′),以及 嗨1 (5′-TAATTGAGAAGCGCCGACGA-3′和5′-GCTTAGCATCCTGCTTCT-3′)。 使用QuantStudio 7 Flex(Thermo Fisher Scientific)和GoTaq DNA聚合酶(Promega M780B)进行分析。 ΔΔ C t 应用方法,将感兴趣基因的表达标准化为 GAPDH公司 表达式( 31).
统计与可视化 在Prism 6(GraphPad)中进行统计分析,显著性水平设置如下:* P <0.05** P <0.005,以及*** P <0.001; 不重要(不重要), P >0.05。 每种生物复制结果至少如图所示。 一个样品 t 检验、单/双向方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis检验与Bonferroni或Dunn的多重比较检验一起应用,如每个图图例所示。 图形是用Prism 6(GraphPad)生成的,示意图表示在 无花果。4和 5图S1是借助于 生物钟。通用域名格式.