Takara 高质量、高产量体外转录（IVT）mRNA合成系统

Takara IVTpro™ mRNA合成系统包含从DNA模板制备到mRNA合成实验所需的全套工具。不仅可以用于mRNA相关的基础研究，还可以用于mRNA疫苗、肿瘤免疫治疗等应用研究！

产品介绍

Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System（Code No. 6141）是能够简便、高效合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA的体外转录试剂盒。它包含以下两种制品（可单独购买）：

① Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）：用于DNA模板构建

本试剂盒用于将模板DNA无缝克隆到预线性化载体（包含在本试剂盒中）中构建用于体外转录反应的模板质粒。预线性化载体中包含T7 启动子、转录起始序列 (AGG)、5'-UTR（非编码区）、3'-UTR、和105-base Poly(A) 序列。试剂盒还包含用于将目标DNA无缝克隆到预线性化载体的In-Fusion Snap Assembly Master Mix和FLuc对照片段（包括15 bp，3' In-Fusion sequence；FLuc CDS；和15 bp，5' In-Fusion sequence）。

② Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）：RNA合成试剂

本试剂盒以含有 T7 启动子序列的双链 DNA 为模板，使用优化的高效T7 RNA聚合酶，通过体外转录可合成大量mRNA。除此以外，还包含用于IVT反应后消化模板DNA的DNase I和用于纯化mRNA的氯化锂 (LiCl) 溶液。真核细胞翻译蛋白质需要RNA的5'端有Cap结构，配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap类似物）可以高效制备具有Cap结构的mRNA。

※ Cap类似物不包含在本产品中，请另外准备CleanCap Reagent AG (TriLink公司)。 

产品特点

◇  通过体外转录（IVT）合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA；
◇  优化的T7 RNA聚合酶用于IVT反应，RNA合成效率高、产量大；
◇  独立包装的NTPs，方便修饰NTPs替换，且不影响mRNA产量；
◇  采用In-Fusion无缝克隆，轻松构建模板质粒DNA；
◇  使用氯化锂（LiCl）溶液进行RNA纯化，可立即进行下游应用。

Takara IVTpro™ mRNA合成系统五大优势：

优势No.1：采用In-Fusion无缝克隆，轻松构建模板质粒DNA。

构建参加IVT反应的DNA模板质粒操作非常简单，只需设计好带有In-Fusion序列的目标基因（GOI），即可一步轻松完成模板质粒的构建！

优势No.2：通过体外转录（IVT）反应合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA。

为什么要合成带有Cap结构的mRNA？

mRNA的5’端帽子结构（m7GpppN）发现于上世纪70年代，它的存在赋予了mRNA稳定性并使其能够有效翻译。在真核细胞中，除了识别蛋白质合成的起始之外，5’端帽子结构还充当从5’到3’外切核酸酶切割的保护基团。也就是说5’Cap相当于一顶钢盔，保护mRNA不受免疫系统降解，因此Cap结构对于mRNA疫苗研发很重要。本试剂盒配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap类似物）可以高效制备具有Cap结构的mRNA。

通过体外转录（IVT）反应合成的 mRNA产量：

此图分别为加入和不加入CleanCap Reagent AG (3'OMe)的情况下，IVT反应溶液中合成Firefly luciferase (萤火虫荧光素酶 ,FLuc) mRNA的产量。由此可见由此可见，Takara IVTpro™ mRNA合成系统兼容CleanCap试剂，使用CleanCap不影响mRNA产量。

优势No.3：优化的T7 RNA聚合酶用于IVT反应，RNA合成效率高、产量大。

使用本产品，每次反应（20 μl 反应体系）可以合成高达 200μg 或更多的RNA。还可以根据需要放大反应体系，即使使用10倍（200μl）反应体系也不影响mRNA预期产量!

IVT反应规模与mRNA产量的关系：

此图为以Positive Control Template（FLuc）为模板，加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe)  进行IVT放大实验（除反应液量外均按说明书所述进行）。 由此可见，mRNA 产量与反应体积成正比，并且按比例放大反应溶液体积不会影响mRNA产量。

优势No.4：独立包装的NTPs，方便修饰NTPs替换，且不影响mRNA产量。

剂盒包含独立包装的NTPs，方便优化或使用修饰NTPs（如假尿苷）进行替换，而且不会明显降低mRNA的产量。

为什么要使用修饰的NTPs？

人体免疫系统会识别进入人体的各种物质并将其清除，RNA也不能例外。而人体中本身就有的RNA，却不会被人体免疫系统识别清除，如tRNA。经科学家们研究发现这些tRNA上的尿苷和体外合成实验获得的RNA上的尿苷结构稍有不同，称之为假尿苷。而使用这种修饰的UTP，可以解决mRNA易被免疫系统识别而被清除的问题。

优势No.5：使用氯化锂（LiCl）溶液进行RNA纯化，可立即进行下游应用。

本试剂盒除了提供用于IVT反应后消化模板DNA的DNase I，还提供了用于纯化mRNA的氯化锂 (LiCl) 溶液，纯化效果更加理想！

氯化锂沉淀法纯化RNA与离心柱法进行比较（Fluc mRNA）

在含有CleanCap Reagent AG（3'OMe）和N1-甲基假尿苷的IVT反应溶液中合成FLuc mRNA，并分别通过LiCl沉淀法和离心柱法进行纯化（NucleoSpin RNA Clean-up）。 结果显示，用离心柱法仅一次洗脱(Elution x1)得到的RNA要比LiCl沉淀法要少，但两次洗脱(Elution x2)的RNA量与LiCl沉淀法大致相同。所以使用离心柱法时我们建议进行两次洗脱，而氯化锂沉淀法仅需一次即可。

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