复旦大学王永明课题组发现Cas9识别简单PAM的规律

　　

复旦大学王永明课题组发现Cas9识别简单PAM的规律

CRISPR/Cas9是一种快速有效的基因编辑工具，但是它在识别DNA时需要目标序列下游有一个特定的序列，称为PAM。PAM越短，在基因中分布就越多，Cas9能编辑的位点就越多。因此，开发识别短PAM的Cas9是研究热点。SaCas9是小型Cas9，能够被单个AAV病毒载体包装递送用于体内基因治疗。SaCas9识别的PAM是NNGRRT，受到4个碱基的限制，在基因组中分布较少。有研究人员将SaCas9识别的PAM改造成了NNNRRT，但是依然受到3个碱基的限制。王永明课题组先前鉴定了16个SaCas9同系物的PAM序列，其中SauriCas9和SlugCas9识别NNGG PAM，只受到2个碱基的限制。

2022年11月，王永明课题组又有新突破，联合东南大学柴人杰团队和苏州大学胡士军团队在PLOS biology上发表了题为“Identification of SaCas9 orthologs containing a conserved serine residue that  determines simple NNGG PAM recognition”的研究论文。该研究分析了Cas9序列和PAM的对应关系，发现识别NNGG PAM的Cas9存在3个保守的氨基酸。如果将其中两个氨基酸替换到SaCas9上面，就能使SaCas9识别NNGG PAM（图1）。

图1. （A）17个SaCas9同系物PI结构域的氨基酸序列。SauriCas9和SlugCas9特有的3个氨基酸用红色标记出来。（B）将SaCas9的2个或者3个氨基酸替换后识别NNGG PAM。

此外，该研究又在数据库中找到了5个含有保守氨基酸的Cas9，实验证实它们都识别NNGG PAM（图2）。

图2. （A）5个新的SaCas9同系物PI结构域的氨基酸序列。特有的氨基酸用红色标记出来。（B）5个SaCas9同系物的PAM序列。

Sha2Cas9和SpeCas9具有很高的编辑活性，但是存在脱靶现象。将Cas9和DNA之间形成非特异性氢键的氨基酸替换后，得到了精准版本的Cas9，极大的减少了脱靶（图3）。Sha2Cas9、SpeCas9和先前开发的SlugCas9都具有姘美SpCas9活性的优点。此外，还具有基因小、编辑范围大、不容易脱靶等优点，是基因编辑的理想工具。

王永明课题组致力于开发小型CRISPR-Cas9工具，建立了高效的筛选平台，先后开发出SauriCas9（NNGG PAM，PLoS Biol 2020）、SlugCas9（NNGG PAM，Nucleic Acids Res 2021）、SchCas9（NNGR PAM，Adv Sci 2022）、NarCas9（NNNNC PAM，eLife 2022）等，不断扩大编辑范围，提高编辑性能。

图3.（A）GFP报告基因分析脱靶。（B）GUIDE-seq全基因组分析脱靶。

复旦大学生命科学学院硕士生王帅和生陶晨是论文的共同第一作者，复旦大学王永明教授，东南大学柴人杰教授和苏州大学胡士军教授是论文的共同通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001897