PacBio HiFi测序——提升麦芽真菌群落多样性研究

PacBio单分子实时测序（SMRT）技术，以其长读长（长度可达25 kb）、高准确率（≥Q30，即超过99.9%的测序精度）、单分子分辨率、高灵敏度、无GC偏好性等优势，在医学、动植物基因组以及微生物研究中都表现出极大的应用优势。今天，就让我们继续分享PacBio HiFi测序在微生物研究中的应用。

研究背景

农产品中的真菌污染和次生代谢物积累是全球食品安全面临的挑战。尽管高通量测序（HTS)有助于解释真菌群落，但它也存在缺点，如短读长、达不到物种级分辨率及鉴定不准确，而三代PacBio SMRT长读长测序可以快速获得高达物种级别分辨率的数据，从而完成复杂真菌群落多样性的高效分析。因此，本研究首次尝试通过PacBio内源转录间隔区（ITS）的全长SMRT测序来表征麦芽中的真菌群落，尤其是产生真菌毒素真菌的多样性，从而探索和比较生麦芽与烘焙麦芽真菌群落之间的差异。相关研究“Single-Molecule Real-Time Sequencing to Explore the Mycobiome Diversity in Malt”于2022年8月发表于Microbiology Spectrum杂志。

研究思路

整体研究思路如图1所示，利用SMRT测序方法进行真菌群落多样性的研究和分析。

图1. 生麦芽和烘焙麦芽真菌群落多样性的SMRT研究。

结果分析

1. 麦芽样品中真菌群落多样性分析

通过对测序样本大小和深度的评估，最终确定分别以10个生麦芽（M组）和烘焙麦芽（CM组）样品的样本量用于后续分析。Alpha多样性分析反映了单个样品中真菌群落的丰富度和多样性，本研究采用ACE、Shannon、Shannon evenness和Good’s coverage四个统计分析指标来反映每个麦芽样品中真菌群落的丰富度、多样性、均匀度和覆盖度。具体数据如表2所示，20个样品的ACE指数均超过150，其中M组样品M8和CM组样品CM2群落丰富度最高，物种数量最多。而样品M3、M4和样品CM6、CM7的真菌群落丰度较低，菌种较少。此外，覆盖率能够反映测序结果是否代表样本中真菌的实际情况，越高的覆盖率就意味着有越多的序列被检测到，该研究所有样本的覆盖度指数均超过0.99，说明SMRT测序具有较高的群落覆盖度，可以代表这些样本中真实的真菌群落。

表2.所有麦芽样品的Alpha多样性指数

Beta多样性分析可以比较这些样本的物种多样性之间的相似性，为提高结果的准确性，该研究在种和属两个层面对样本的Beta多样性进行分析，用主坐标分析（PcoA）比较两组间物种组成的差异，如图4所示，在属水平上，主坐标1 (PC1)和主坐标2分别占所有原始信息的45.3%和19.99%，总和分别为65.29%和＞50%(图4a)，说明这两个主坐标对样品中真菌成分差异的解释程度较高；而在种水平(图4b)， PC1和PC2分别占所有原始信息的34.97%和18.57%，与属水平的结果基本一致。

图4. 在属(a)和种(b)水平上基于Bray-Curtis距离的PCoA图。

2.麦芽样品中的真菌群落组成

对麦芽中特定分类成分的广泛分析可以直观地显示真菌群落结构，为后续真菌群落差异、关联、进化和功能预测的分析提供基础。因此，本研究详细讨论了每个麦芽样品的分类学组成，特别强调优势种和产毒真菌，并对一些代表性的真菌进行了定量PCR的验证。20份样品经SMRT测序共鉴定1界6门23纲56目120科188属333种。真菌群落在门、属和种水平上的组成柱状图如图5所示。另外，此次测序也检测到了UNITE 8.0数据库中的根瘤菌(Rhizopus arrhizus)序列，NCBI中该物种对应的OTUs的BLAST结果也为Rhizopus arrhizus，表明第三代SMRT测序在检测物种水平上的可靠性，相比于第二代HTS技术，能够更准确地表征麦芽样品中的真菌群落结构。

图5. 真菌在门(a)、属(b)和种(c)水平上的组成柱状图。

为进一步可视化优势属在不同组麦芽样品中的比例，研究人员又创建了属水平的Circos图，如图6所示。虽然，与M组相比，CM组的麦芽样品只增加了一次焙烧处理，但M组生麦芽样品和CM组烘焙麦芽样品的真菌群落存在显著差异，并且，烘焙处理很可能通过促进或抑制某些真菌群落来促进结构和成分的变化，从而降低烘焙麦芽中某些产毒真菌引起的风险。

图6. 在属水平上揭示麦芽样品和真菌之间关系的Circos图。

3.生麦芽和烘焙麦芽的真菌群落比较

烘焙麦芽是通过简单地烘烤生麦芽获得的，它可以改变原有的味道，防止霉菌和昆虫污染，但不能杀死或完全消除现有的霉菌。本研究鉴定了生麦芽和烘焙麦芽真菌群落结构的差异，结果显示，CM组比M组有更多的独特物种，这可能是在焙烧过程中通过环境引入的；基于Bray-Curtis距离的相似度(ANOSIM)分析图(图7a)显示，两组间的差异比组内的差异更显著；通过线性判别分析（LefSe），探讨两组间统计学差异的生物标志物，并估计各组分(种)丰度的影响，如图7b，黄色圆圈标记的节点表示M组和CM组之间无显著差异，红色和蓝色节点分别代表M和CM组在丰度上的显著差异，其中，Wickerhamomyces excepus是差异最大的物种。

图7. 基于Bray-Curtis距离的ANOSIM分析图。

4. 真菌的相关性分析

本研究讨论了真菌之间的相关性，以确定它们的相互作用机制，图9所示为前50个属的相对丰度Spearman相关网络图。根据属间的相关性得出不同类群在同一环境下的相互作用，进一步解释M组和CM组之间表型差异形成的机制，从而在在实际操作中，对这些产毒真菌以及其他相关真菌进行监测，以确保麦芽及其衍生产品的质量和安全。

图9. 前50个属的相对丰度Spearman相关网络图，探讨真菌之间的相关性
（红线代表真菌的正相关关系，绿线代表负相关关系，厚度代表相关程度）。

本研究通过PacBio内源转录间隔区（ITS）的全长SMRT测序来表征麦芽中真菌群落多样性，探索和比较生麦芽与烘焙麦芽真菌群落之间的差异。研究结果为后续真菌菌群功能分析和早期风险预警提供了有力的依据，为麦芽的质量安全控制提供了参考。这也是首次利用第三代PacBio SMRT技术探索食用和药用麦芽真菌群落多样性的研究，并基于测序数据对未来的应用前景进行了评估。

微生物物种数量庞大，而环境微生物复杂性决定了其对研究技术的高要求。以SMRT HiFi测序技术为代表的三代测序的出现，为微生物的研究提供了一次新的技术变革。而基于SMRT HiFi测序不仅可以进行真菌群落多样性的研究，同样也为微生物16S rRNA基因全长测序研究，为组装完整可靠的宏基因组和微生物全基因组提供了新的选择和方法。

文献链接：doi: https://doi.org/10.1128/spectrum.00511-22

基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。