CRISPR文库火“出圈”啦！还不会用？这篇给你从头到尾梳理一遍！

最近CRISPR文库火“出圈”了，小源在这里整理了一份CRISPR文库速记攻略，帮助你快速了解CRISPR文库！攻略主要包括以下几个部分：

1. CRISPR文库简介
2. CRISPR文库有哪些应用？
  2.1筛选癌症治疗相关靶点
    2.1.1识别肿瘤驱动基因
    2.1.2筛选合成致死基因对
    2.1.3筛选肿瘤耐药基因
  2.2筛选病毒感染相关的宿主因子
  2.3其他（信号通路、抗体靶标）
3. CRISPR文库分类以及如何选择？
  3.1筛选范围（全基因组/亚文库，现货/定制）
  3.2筛选要求（功能缺失/功能获得/单细胞测序/点突变文库）
  3.3筛选目的（阳性筛选/阴性筛选）
4. CRISPR文库如何构建与筛选？

CRISPR文库简介

CRISPR文库是基于CRISPR/Cas9技术建立的高通量基因筛选方案。通过高通量合成sgRNA构建质粒文库，包装为慢病毒后以低MOI（通常＜0.3）感染待筛选细胞，确保一个细胞只进入一种sgRNA，再给细胞加以筛选因素（如药物处理、低氧处理、病毒感染或细胞本身的生存能力等），收集筛选后的细胞进行NGS测序，分析实验组与对照组之间sgRNA的富集或耗竭情况，获得与筛选因素相关的宿主因子。

相比cDNA文库与RNAi文库，CRISPR/Cas9具有多功能性、低噪声、高敲除效率和较小的脱靶效应的优势，是大规模基因功能筛选的首选平台。

CRISPR文库有哪些应用？

1. 癌症治疗

1）识别肿瘤必需基因，针对致癌基因进行靶向治疗。

恶性肿瘤累积了很多基因突变，但这些肿瘤细胞维持恶性表型通常只依赖其中某个/某些突变活化的癌基因，这种现象叫癌基因成瘾（oncogene addiction），这些癌基因也称为驱动癌基因（driver oncogenes）。阻断这些驱动基因的活性可以诱导肿瘤细胞发生快速调亡、生长阻滞或分化，而对正常细胞影响较小，这种差异化为肿瘤的靶向治疗带来了希望。

近年来二代测序的广泛应用已经找出很多肿瘤细胞存在的突变点，但是无法很好的区分哪些是驱动突变。通过基因失活找出肿瘤细胞生存依赖的驱动基因是个更简单直接的方法。CRISPR文库可以同时靶向全基因组不同基因，是实现高通量基因失活的绝佳工具。2014年，Shalem等[1]首次利用GeCKO文库鉴定出人黑色素瘤细胞和多能干细胞存活的关键基因（图1）。Wang等[2]利用CRISPR全基因组文库筛选将NCAPG鉴定为肝细胞癌肿瘤生长的必须癌基因。Kiessling等[3]利用CRISPR全基因组文库筛选验证了HCC-827细胞的驱动基因EGFR和CHP-212细胞的驱动基因NRAS和MEK1，同时发现了新的驱动基因TBK1和TRIB2并用于进一步研究。

图1. 利用CRISPR文库筛选A375与HUES62存活必需基因

2）筛选合成致死作用靶点，实现精准治疗。

针对致癌基因可以使用抑制剂进行靶向治疗，而对于抑癌基因而言，其功能的失活导致无法直接靶向，通常采用靶向与失活的抑癌基因具有合成致死作用的基因搭档。合成致死（Synthetic lethality）指两个非致死基因同时失活导致细胞死亡的现象。假如肿瘤细胞中存在特定基因A失活，那么用药物抑制它的合成致死搭档基因B，使两者都失活，而健康的体细胞因为有正常的基因A，能够保证正常的生理功能的表达，不会受到药物的伤害，从而只特异性的杀死该类肿瘤细胞（如图2）[4]。

图2. 合成致死疗法

合成致死最典型的应用就是PARP抑制剂治疗BRCA1/2突变的肿瘤，截止2020年，PARP抑制剂全球销售额已经超过20亿美元！那么如何寻找更多具有合成致死作用的基因对呢？CRISPR文库高通量筛选起了大作用！CRISPR文库筛选合成致死作用一般有两种逻辑，一种是直接设计双重打靶的gRNA载体，即在一个细胞内同时靶向两个基因，筛选具有合成致死作用的基因对， Shen等[5]采用这种方法对3种实验癌细胞系（Hela、A549和293T）中的73个基因进行了150000个组合的筛选，找出120种有合成致死作用的基因对（如图3）。另外一种逻辑就是在单个抑癌基因敲除的细胞系上进行文库筛选，筛出与敲除的抑癌基因具有合成致死作用的靶点，Feng等[6]就是采用这种方法先在293A细胞上构建了12个已知抑癌基因敲除细胞系，再用全基因组敲除文库对野生型和敲除细胞系进行CRISPR筛选，分析同一细胞筛选前后gRNA的丰度变化，通过对比野生型和抑癌基因敲除细胞系在CRISPR筛选后gRNA的丰度差异确定潜在的合成致死基因。

图3. 利用CRISPR文库筛选基因相互作用关系

3）寻找肿瘤耐药相关基因，研究耐药机制，优化治疗方案。

肿瘤分子靶向药物面临的主要问题是耐药，因此探讨靶向药物的耐药机制有着重要的临床意义。经CRISPR文库正向筛选，绝大部分细胞因对药物敏感而死亡，部分细胞由于发生特定基因敲除产生抗药性而存活了下来。通过检测存活细胞携带的gRNA可以将与耐药性产生相关的基因筛选出来。

Vemurafenib被批准用于携带BRAFV600E 突变的晚期黑色素瘤的治疗。为了研究Vemurafenib的耐药机制，Shalem等[1]设计了包含64751条sgRNA、靶向全基因组18080个基因的敲除文库，经过细胞感染，加药富集，最终筛选出nf1、med12、nf2、cul3、tada2b和tada1等耐药相关基因，并提出了新的Vemurafenib肿瘤耐药机制假说。

2. 筛选病毒感染相关的宿主因子

CRISPR文库筛选还常用于研究病毒感染相关的宿主因子。针对丙肝病毒、登革病毒、日本脑炎病毒和西尼罗病毒,目前已经筛选出了一批与内质网功能以及受体相关的宿主因子。如，Zhang等人[7]通过CRISPR/Cas9 的全基因组筛选验证了黄病毒感染所需的九个人类基因，这些基因都与内质网 (ER) 功能（包括易位、蛋白质降解和 N-连接糖基化）相关。Ma等人[8]通过设计包含77,406个sgRNAs、针对20,121个基因的文库，对全基因组进行筛选，得出EMC2、EMC3、SEL1L等7个附属于内质网相关蛋白降解通路（ERAD）的基因。进一步实验表明，敲除这些基因后不会阻止西尼罗病毒（WNV）的复制，但会阻止该病毒致死细胞。

3. 信号通路、抗体靶标等

除了肿瘤相关基因筛选和病毒感染宿主因子筛选，CRISPR文库筛选还在抗体靶标筛选、细胞信号通路研究、非编码基因功能研究等方面有着广泛的应用。

CRISPR文库分类以及如何选择？

文库的类型很多，如果不够了解，可能就选择困难了。下面我们就从三个分类维度来教大家如何区分文库类型以及如何选择合适的文库：

1. 筛选范围（全基因组/亚文库？）

从文库大小可以分为全基因组文库和亚文库，全基因组文库通常是针对某一物种所有编码基因设计打靶gRNA，覆盖面大，但与此同时其筛选工作量也将很庞大。亚文库或子文库指某一类基因的组合，比如某个基因家族、某个信号通路等。目前已构建好的现货文库有很多，如人/小鼠/绿猴的全基因组文库，激酶、核蛋白、细胞周期蛋白、代谢相关蛋白和表观遗传相关蛋白亚文库等。一般要根据具体需求选择文库范围，其次优先选择有现货的文库，最后选择能满足筛选要求的最小文库，尽可能减小后续的筛选工作量。

源井可提供人/小鼠全基因组文库，激酶、核蛋白、细胞周期蛋白、代谢相关蛋白和表观遗传相关蛋白亚文库等CRISPR现货文库，覆盖度>99%，均一性<10，点击了解产品详情>>

2. 筛选要求（功能缺失/功能获得/其他？）

确定了筛选范围，就要考虑筛选要求了，明确研究目的是需要进行功能缺失型（Loss-of-function）筛选，还是功能获得型（Gain-of-function）筛选？前者一般选择CRISPR-KO或CRISPRi系统进行构建，一般来说CRISPR-KO的敲除效果更好，但是对于细胞必需基因（敲除后致死）或者非编码基因（不编码蛋白，无法造成移码）而言，CRISPRi系统是个更好的选择。CRISPRi系统是将催化失活的dCas9与转录抑制因子组成融合蛋白，与靶向基因上游调控区域的gRNA共转染实现基因敲降。如若需要进行功能获得型筛选则选择CRISPRa系统，CRISPRa系统是通过将催化失活的dCas9与转录激活因子连接，靶向基因上游调控区域增强基因表达。

其他要求：1）Barcode文库：传统的CRISPR pool筛选一般要求是与细胞增殖/存活相关的表型，这样有利于特定细胞的富集。但如果是不明显的表型，如新陈代谢、组织稳态等，则需要借助单细胞测序技术对单个细胞进行转录组分析。在这种情况下，构建文库时还可能需要改造CRISPR骨架，增加相应的barcode序列。2）Base editing文库：利用Base editing的方法（CBE、ABE等）构建针对某个基因或某些基因的单碱基突变（SNVs）文库。

图4. CRISPR文库类型

3.筛选目的（阳性筛选/阴性筛选？）

根据筛选目的的不同，可以分为阳性筛选和阴性筛选（也叫正向筛选和负向筛选）。阳性筛选是对已成功整合sgRNA的细胞文库施加一定的筛选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，达到富集关键基因的目的。阴性筛选则与之相反，存活的细胞并不是目的表型细胞，需要比较不同时间点sgRNA的丰度找出差异sgRNA才能确定关键基因，但阴性筛选可以鉴定出引起细胞某些功能缺失的基因。如果拉长筛选时间，还可以筛选到细胞生存所必需的基因。前面提到的应用案例中，筛选驱动基因和合成致死基因属于阴性筛选，而筛选耐药性基因和病毒感染所需的宿主因子则属于阳性筛选。

CRISPR文库如何构建与筛选？

1. 文库构建：针对某个物种，每个基因设计3-6条sgRNA，采用高通量芯片合成sgRNA，再将合成的sgRNA通过Gibson组装克隆到慢病毒载体中。

2. 病毒包装与转导：将质粒文库包装成慢病毒，并以低MOI（一般标准<0.3）感染靶细胞，保证一个病毒颗粒感染一个细胞。细胞文库中包含的细胞的数量一般为全部sgRNA数量的200-1000倍。

3. 细胞筛选：将全基因组敲除细胞库分成两份，其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染，药物治疗等；另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。

4. NGS测序与数据分析：将实验组和对照组的细胞分别抽提基因组，PCR扩增sgRNA片段，进行NGS测序，并进行生物信息学分析。

5. 基因功能验证：通过CRISPR/Cas9敲除单个候选基因，或进行过表达/回补实验，进行基因功能验证。

源井CRISPR文库服务亮点：

①红棉CRISPR基因编辑系统：高通量自动化设计gRNA，确保gRNA特异性和切割效率。

②确保高转化效率：使用自主研发的超级感受态，并采用电转的方式提高转化效率，严格把控长菌数量≥500X，确保转化效率。保证文库覆盖度＞99%和均一性＜10。

③丰富的慢病毒包装经验：确保病毒滴度和纯度及混合质粒病毒包装过程的均一性。

④近100种Cas9稳转株现货：省去Cas9病毒感染环节，文库筛选周期缩短3-5周。

⑤经验丰富平台完善：丰富的细胞培养经验和完善的下游表型分析平台，可以提供多种细胞筛选服务。

⑥CRISPR-UTM细胞基因编辑平台：已在超200种细胞上积累5000+成功案例，提供基因功能验证服务，保证交付KO纯合克隆。

图5. CRISPR构建与筛选流程图

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文献参考

[1] Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelson T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-87. doi: 10.1126/science.1247005. Epub 2013 Dec 12. PMID: 24336571; PMCID: PMC4089965.

[2] Wang Y, Gao B, Tan PY, Handoko YA, Sekar K, Deivasigamani A, Seshachalam VP, OuYang HY, Shi M, Xie C, Goh BKP, Ooi LL, Man Hui K. Genome-wide CRISPR knockout screens identify NCAPG as an essential oncogene for hepatocellular carcinoma tumor growth. FASEB J. 2019 Aug;33(8):8759-8770. doi: 10.1096/fj.201802213RR. Epub 2019 Apr 25. PMID: 31022357; PMCID: PMC6662966.

[3] Kiessling M K, Schuierer S, Stertz S, et al. Identification of oncogenic driver mutations by genome-wide CRISPR-Cas9 dropout screening[J]. BMC genomics, 2016, 17(1): 1-16.

[4] Sasaki M, Ogiwara H. Synthetic lethal therapy based on targeting the vulnerability of SWI/SNF chromatin remodeling complex‐deficient cancers[J]. Cancer Science, 2020, 111(3): 774-782.

[5] Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, Bojorquez-Gomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN, Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, Ideker T, Mali P. Combinatorial CRISPR-Cas9 screens for de novo mapping of genetic interactions. Nat Methods. 2017 Jun;14(6):573-576. doi: 10.1038/nmeth.4225. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28319113; PMCID: PMC5449203.

[6] Feng X, Tang M, Dede M, et al. Genome-wide CRISPR screens using isogenic cells reveal vulnerabilities conferred by loss of tumor suppressors[J]. Science advances, 2022, 8(19): eabm6638.

[7] Zhang R, Miner JJ, Gorman MJ, Rausch K, Ramage H, White JP, Zuiani A, Zhang P, Fernandez E, Zhang Q, Dowd KA, Pierson TC, Cherry S, Diamond MS. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 2016 Jul 7;535(7610):164-8. doi: 10.1038/nature18625. Epub 2016 Jun 17. PMID: 27383988; PMCID: PMC4945490.

[8] Ma H, Dang Y, Wu Y, Jia G, Anaya E, Zhang J, Abraham S, Choi JG, Shi G, Qi L, Manjunath N, Wu H. A CRISPR-Based Screen Identifies Genes Essential for West-Nile-Virus-Induced Cell Death. Cell Rep. 2015 Jul 28;12(4):673-83. doi: 10.1016/j.celrep.2015.06.049. Epub 2015 Jul 16. PMID: 26190106; PMCID: PMC4559080.