科学家将Prime Editing技术应用于小立碗藓和马铃薯

　　

CRISPR-Cas9技术自首次应用于植物基因组编辑以来，已彻底改变了植物研究和作物育种。不过，尽管经典的CRISPR-Cas9系统能够靶向诱变，但在核苷酸替换方面大多效率不高，而且还存在脱靶效应。2019年，博德研究所David Liu实验室开发出Prime Editing技术，可实现精准的碱基“查找和替换”，为植物育种增添了新工具。

近日，法国巴黎萨克雷大学的研究人员将Prime Editing技术成功地应用在小立碗藓和马铃薯这两种植物上，为未来的精确作物育种铺平了道路。这项研究成果发表在《Plant Science》杂志上。

Prime Editing系统采用了经过改造的向导RNA（pegRNA）和prime editor融合蛋白。pegRNA具有双重功能，既能够将编辑蛋白引导到目标位点，又含有编辑的模板序列。prime editor蛋白则由Cas9切口酶和逆转录酶融合而成。在Cas9酶切目标位点后，逆转录酶以pegRNA为模板进行逆转录，然后将DNA直接聚合到切口的DNA链上。

自开发以来，Prime Editing技术已经成功应用在几种植物上，如水稻、小麦和玉米等。在这项研究中，研究人员想评估这种技术在两种不同植物上的潜力，包括模式生物小立碗藓（Physcomitrium patens）和高度杂合的四倍体马铃薯（Solanum tuberosum）。

为了快速鉴定编辑结果，他们对每种植物使用不同的报告系统。对于小立碗藓，他们选择了PpAPT基因，它能够将2-氟腺嘌呤（2FA）转化为2-氟-AMP，而后者是一种可用于植物反向选择的致死化合物。因此，PpAPT基因的编辑将赋予植物在含有2FA的培养基上生长的能力（图1）。对于马铃薯，他们选择对乙酰乳腺合成酶（ALS）基因进行修饰，使其对除草剂氯磺隆（chlorsulfuron）具有抗性。

图1. 对PpAPT基因进行精确修饰的Prime Editing策略

对小立碗藓的基因编辑

研究人员测试了PE2和PE3两个版本的编辑系统，这两个版本的区别在于PE3增加了可切断非编码链的sgRNA。他们发现，PE2能够在小立碗藓中发挥作用，8条pegRNA中的6条产生了具有2FA抗性的植株。其中，Prime Editing酶的编码序列以及表达pegRNA的元件由Twist Bioscience公司合成。

值得注意的是，即使是效果最好的6号pegRNA，在PpAPT基因座上观察到的突变频率也比标准的Cas9或Base Editor低两个数量级（表1）。不过，编辑的精准性，证明了Prime Editing在小立碗藓上的特异性。此外，PE3尽管增加了对非编码链的剪切，但并没有提高所获编辑的质量和数量。

表1. 在苔藓中使用PE2和PE3的效率

在使用Cas9技术时，基因编辑的特异性是一个长期存在的问题。因此，研究人员此次也开展了脱靶分析。他们设计引物来扩增每个预测的脱靶位点，并对扩增子进行测序。他们发现，Prime Editing在小立碗藓中具有高度特异性，这些预测位点上没有检测出任何修饰。

对马铃薯的基因编辑

之后，他们又在马铃薯栽培品种Desiree上评估了PE2和PE3。基因编辑的靶点是StALS1和StALS2基因（他们使用的pegRNA-stALS和sgRNA-StALS构建体也由Twist Bioscience公司合成）。高分辨率熔解曲线（HRM）分析表明，在含有氯磺隆的培养基上再生的两株植物中，一株的熔解曲线图与对照相似（它逃脱了选择压力），而另一株在目标基因座上显示出突变曲线。

后续的分析证实，PE2编辑实现了预期的碱基替换，但在氯磺隆培养基上生长的抗性植株数量非常少。此外，PE3未能在马铃薯中实现对ALS基因的编辑。这种低效率是否与pegRNA的结构有关？研究人员在分析后发现，pegRNA结构并没有显著破坏Cas9活性，效率低的原因可能不是靶向目标位点的效果不佳。

研究人员总结到，与标准的Cas9技术或Base Editor技术相比，Prime Editing在小立碗藓和马铃薯中的总体编辑效率比较低。标准Cas9的植物诱变效率通常可达到80%，而Prime Editing编辑效率最高只达到51%（玉米）。他们认为，表达系统之间的差异可以部分解释这些变化。通过更换启动子，有望提高编辑效率，特别是在马铃薯中。

他们认为，Prime Editing的优势在于能够在目标位点实现精确的编辑，而且在预测的脱靶位点没有发生脱靶诱变，但它仍需要进一步改进，才能广泛用于基础研究和精确作物育种。对于营养繁殖和多倍体植物而言，这种改进尤为必要。

原文检索

Perroud PF, Guyon-Debast A, Veillet F, Kermarrec MP, Chauvin L, Chauvin JE, Gallois JL, Nogué F. Prime Editing in the model plant Physcomitrium patens and its potential in the tetraploid potato. Plant Sci. 2022 Mar; 316: 111162. doi: 10.1016/j.plantsci.2021.111162.