新技术:体外Ribo-seq(INRI-seq) 以无细胞方式进行全局翻译研究

核糖体分析 (Ribo-seq)常用于在转录组范围内评估蛋白质合成速率和研究翻译控制机制，但仍有许多局限性。德国研究人员开发了体外Ribo-seq(INRI-seq)，一种以无细胞的形式、可分析自定义合成转录组的翻译图谱的方法。他们用大肠杆菌系统展示了如何使用INRI-seq分析感兴趣的转录组的翻译起始位点，还研究了反义肽核酸 (PNA) 的直接翻译抑制的总体影响，分析PNA脱靶效应。

　　

蛋白质合成是活细胞中最耗能的过程之一，其精确调节成为细胞经济的关键问题。虽然在全局基因表达分析中，通常用 RNA 测序 (RNA-seq) 确定的 mRNA 水平作为分析蛋白质合成的替代，但最终蛋白质丰度并不总是与 mRNA 水平相关。这是由于还有mRNA的转录后调控（小分子RNA (sRNA)）、翻译调控、翻译后修饰等多种调节机制。

在过去十年中，核糖体分析 (Ribo-seq) 已成为在转录组范围内评估蛋白质合成速率和研究翻译控制机制的主要方法。Ribo-seq 基于对核糖体保护片段 (RPF)——即mRNA上的核糖体结合位点——进行 RNA-seq 分析，这些核糖体覆盖/结合的片段能够在细胞裂解后的核酸酶处理过程中保留下来。由于每个核糖体保护片段代表一个核糖体的位置，它们的总和不仅揭示了哪些 mRNA，而且还揭示了这些 mRNA 的编码序列 (CDS) 的哪些部分被翻译，可用于绘制体内主动翻译核糖体的图谱，以提供有关翻译暂停、停滞和翻译起始位点使用的全局信息，以及蛋白质拷贝数的估计。

虽然 Ribo-seq 极大地推进了翻译相关过程的研究，但该方法也有限制。弱表达基因的覆盖仍然具有挑战性，导致许多基因——包括在正常生长条件下具有极低表达的某些基因类别，例如仅由导致细胞死亡或生长抑制的特定压力触发表达的毒素——难以被检测到。同样，来自人类肠道的微生物的 Ribo-seq仍然很困难，因为其中许多无法在实验室中培养。在机制层面上，Ribo-seq 对那些影响翻译的分子的研究可能会受到细胞反应的阻碍。此外，由于 Ribo-seq 是在活细胞上进行的，因此很难剖析对翻译的直接和间接影响。

为了克服其中的一些限制，Würzburg大学(JMU)的一个研究小组开发一种新技术：体外Ribo-seq (INRI-seq)，用于以无细胞方式进行全局翻译研究。INRI-seq 使用市售的 PURExpress体外翻译系统，与体外合成的、完全可自定义的转录组相结合，可更好地控制单个 mRNA 水平。“我们已经开发了一种技术，可以用来分析一个完全可定制的合成转录组的翻译景观，换句话说，一个细胞外的转录组，。。。有了INRI-seq，就不再需要翻译调节物质穿过细胞膜或从大量活细胞中提取核糖体，”Vogel是JMU分子感染生物学研究所的主任，也是这项研究的主要作者，他概述了该技术的优势。“对于那些你想研究的、通常很珍贵的材料，比如一种只能小规模生产的新抗生素，INRI-seq只需要用更少的材料，因此能节省时间和金钱。”

 

实验成功率高

作者将 INRI-seq 应用于合成大肠杆菌转录组并证明该方法能忠实地验证已知的翻译起始位点，并可用于预测新的翻译起始位点。与在活细胞上进行的技术上类似的研究相比，INRI-seq识别了几乎四倍多的转译过程起始位点，显示出它的高灵敏度。此外，他们使用该系统来研究反义肽核酸 (PNA) 对翻译抑制的保真度，证明中靶特异性和定义影响这些短反义寡聚体脱靶效应的碱基配对标准。INRI-seq 作为一种可扩展的灵敏替代方法，具有巨大的潜力，可用于研究其他生物体和生物群落（包括真核生物）中的翻译控制机制和翻译调节化合物，可以在转录组范围内研究翻译起始位点，而不会因从活细胞中提取核糖体而产生潜在混淆效应。这是迄今为止使用的方法的一个显著改进，他们在最新一期的《核酸研究》杂志上发表了他们的研究成果。