创新技术EZ Clear:小鼠全器官透明成像

一种新的组织透明化处理方法简化并加快了将组织呈现为光学透明的过程，使完整的组织或器官能够进行3D成像，在不影响组织结构的情况下探索器官的三维空间结构。

　　

眼见为实。整体器官透明化成像能够让研究人员在不影响组织结构的情况下探索器官的三维空间结构。但复杂、费力的程序，昂贵的设备，以及使用危险的有机溶剂，阻碍了这些方法的广泛采用。

贝勒医学院的Chih-Wei Logan Hsu博士和Joshua D. Wythe博士团队开发了一种名为EZ Clear的创新技术，这种简单而快速的新方法加快了将组织呈现为光学透明的过程，只需简单的三步即可在48小时内实现整个成年小鼠器官透明化，从而实现整个完整组织甚至整个器官的3D成像。样品在整个处理过程中保持室温和水合状态，在不改变样品大小的情况下，能保存内源性和合成荧光。成像后，使用EZ Clear处理的样本可以进行下游应用，例如组织包埋和冷冻切片，然后进行标准组织学或免疫荧光染色，而不会丢失来自内源性或合成报告标记的荧光信号。使用EZ Clear处理的大量成年小鼠大脑可以成功地用于荧光成像的免疫标记，同时仍然保留来自内源性荧光报告标记的信号。总的来说，EZ Clear的简单性、速度和灵活性使其易于适应和实施生物医学研究中的各种成像模式。

他们的新方法发表在《eLife》杂志上，是在贝勒大学的光学成像和生命显微镜核心(OiVM)开发的。全器官成像已经彻底改变了生物学，使得在不影响组织结构的情况下探索三维空间的器官成为可能。EZ Clear使用三个简单的步骤：脂质去除、清洗和RI匹配，有效地使整个成年小鼠器官在48小时内光学透明。EZ Clear结合了溶剂介导的脂质去除和高水混溶性四氢呋喃(THF)的优点，使样品在水溶液中透明，高RI (n=1.518)样品安装和成像溶液与大多数显微镜平台兼容。由于样品在整个过程中都浸泡在水环境中，在组织处理过程中样品大小没有发生显著变化。

步骤1：将固定样品浸入由50% (v/v) THF组成的脱脂溶液中，浸泡在无菌milliq水中。这一配方允许四氢呋喃从组织中溶解脂质，同时器官在水环境中保持水化。2：去除脂质后，样品在无菌milliq水中孵育4小时，以清洗并去除组织中残留的四氢呋喃；3：将组织浸入室温下的RI匹配成像水溶液(EZ View, RI = 1.518) 24小时，使其透明。EZ Clear不仅使整个大脑像3DISCO和FAST 3D处理一样透明，而且处理时间最短(48小时)，程序最简单(三步)，是目前组织处理中最简单的。由于样品在整个过程中都保持在水环境中，处理后的样品的大小在整个过程中保持不变，不会显著缩小或扩大。此外，内源性转基因荧光报告标记活性在整个EZ Clear处理中都被保留下来，使用EZ Clear处理的Thy1-EGFP神经元报告细胞系的大脑在通过光片显微镜成像总成像深度为5毫米时，在神经元中保留了强大的信号。EZ Clear也与成年小鼠的大脑以外的器官兼容，在组织处理后具有良好的透明度。在血管灌注远红色荧光结合番茄凝集素(凝集素- dylight 649)标记内皮细胞后，收集多个成年小鼠器官(眼睛、心脏、肾脏、睾丸和卵巢)。灌注后固定标本，用EZ Clear处理。LSFM对样品的整体成像显示凝集素-649信号是稳健的，保存良好。这些结果表明，EZ Clear在48小时内通过三个简单的步骤，有效地使成年小鼠器官光学透明，同时保存合成和内源性荧光报告标记的信号。

Hsu说:“以前的方法复杂、费力，通常需要昂贵的设备，还需要使用有害的有机溶剂，所有这些都阻碍了这些方法的广泛采用。”Hsu是OiVM的联合主任，也是贝勒大学综合生理学和教育、创新和技术的助理教授。“这些困难促使我们开发一个更简单的清理过程，用户可以更容易地完成，节省时间和宝贵的资源，专注于他们想要在系统中调查的实际问题。”“这种方法的美妙之处在于，你可以从全局或宏观的角度分析样本，而不干扰组织或器官的自然组织，”贝勒大学综合生理学和神经外科副教授Wythe说。他也是Dan L Duncan综合癌症中心和心血管研究所的成员。

例如，研究人员现在可以看到眼睛和大脑之间的神经元连接。如果用组织切片，这个过程将会扰乱组织的自然结构，而且很难在3D中重建，这限制了我们对更大体积或更大区域内神经元和其他周围细胞之间联系的理解。3D成像绕过了这些限制，EZ Clear的出现使得大多数现代分子生物学实验室都可以使用3D成像技术。”EZ Clear还能够保留了内源性和合成标记方法，而不改变样本量。该方法能透明化和标记大脑内的神经元和血管，以及眼睛、心脏、肾脏、睾丸和卵巢内的血管，小鼠肺、肝和胰腺的整个器官。

Wythe说:“EZ Clear消除了以前的技术障碍，允许研究人员从宏观、整个器官水平到细胞分辨率检查他们感兴趣的器官。”“它消除了以前在实用、安全和经济方面的挑战，同时提供可复制的、高质量的整个器官可视化，这是一个重要的视角，因为它可以为正在研究的主题提供新的见解。”

EZ Clear比以前的处理方法更快，更便宜，更简单。研究人员现在可以在OiVM学习这种更容易完成、可复制的组织处理过程。然后他们可以在自己的实验室中实施，只需要简单的三个步骤，就可以在48小时内获得结果，而其他方法需要数周甚至数月才能完成处理。然后，他们可以把处理过的器官送到OiVM进行3D成像和分析。

Journal Reference:

1. Chih-Wei Hsu, Juan Cerda, Jason M Kirk, Williamson D Turner, Tara L Rasmussen, Carlos P Flores Suarez, Mary E Dickinson, Joshua D Wythe. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife, 2022; 11 DOI: 10.7554/eLife.77419

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