跨膜内质网相关E3泛素连接酶TRIM13抑制致病性DNA触发的炎症反应

跨膜内质网相关E3泛素连接酶TRIM13抑制致病性DNA触发的炎症反应

　　

摘要

内质网（ER）是干扰素基因的局部刺激因子（STING），是致病性DNA触发的先天性反应的核心适配器。螫刺的异常激活会导致自身炎症和自身免疫性疾病，这引起了人们的关注，即在对致病性dna的先天反应中，刺是如何被精细调节的。在这里，我们报道了跨膜结构域（TM）的ER定位的E3泛素连接酶TRIM13（包含13的三重基序）对于抑制致病性dna的炎症反应是必需的。TRIM13缺乏可增强致病性DNA触发的炎症细胞因子的产生，抑制DNA病毒复制，并导致与年龄相关的自身炎症。在机械上，TRIM13通过TM与STING相互作用并催化Lys⁶-尾刺的多泛素化作用，导致尾水管出口减慢，内质网启动的尾刺降解加速。刺缺乏逆转TRIM13基因敲除小鼠的固有抗DNA病毒反应增强。我们的研究揭示了一种潜在的策略来控制由跨膜内质网相关的TRIM13在致病性DNA触发的炎症反应中的稳态。

简介

先天免疫是宿主抵御病原体入侵的第一道也是最快的防线。宿主细胞在识别保守的病原体相关分子模式和宿主损伤相关的分子模式时，通过多种模式识别受体（如Toll-like receptors，TLRs）启动固有免疫应答；核苷酸结合和寡聚化，富含亮氨酸的蛋白质（NLRs）；维甲酸诱导基因I（RIG-I）样受体；黑色素瘤2样受体缺失；以及DNA受体(1)尽管自身免疫性疾病的自身免疫反应与自身免疫性疾病的重要信号通路有关(1).

来源于病原体（如细菌基因组DNA、DNA病毒、寄生虫和逆转录病毒在生命周期中产生的DNA）和自身来源的DNA（如线粒体和细胞核释放到胞浆和囊泡中的胞外DNA并被宿主细胞摄取）是DNA传感器强有力的免疫刺激剂(2–5).环鸟苷-单磷酸腺苷合酶（cGAS）以及其他DNA传感器[如干扰素（IFN）γ诱导蛋白16（IFI16）、死盒螺旋酶41（DDX41）、Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）和异种核核糖核蛋白A2/B1（HRNPA2B1）]，负责识别致病性DNA(1–6)这些DNA传感器启动信号通路，聚集在核心接合器刺（IFN基因的刺激物；也是IFN调节因子3（IRF3）激活（MITA）、内质网（ER）IFN刺激器（ERIS）、蛋氨酸脯氨酸酪氨酸丝氨酸氨基酸序列含蛋白（MPYS）或跨膜蛋白173的信号通路（TMEM173）](7–11)STING是一种跨膜内质网定位蛋白，在抗DNA病毒应答中起着不可或缺的作用(7,8)作为对细菌环二核苷酸（CDN）或cGAS催化的cGAMP的反应，STING离开内质网，然后通过内质网-高尔基中间室（ERGIC）转运到高尔基体，其中，STING招募TBK1[肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）家族成员相关核因子κB（NF-κB）激活因子（TANK）-结合激酶1]，并激活IRF3-和NF-κB-转录因子，导致炎性细胞因子的产生和IFN刺激基因（ISG）的表达(2–5)STING也与细胞死亡、肿瘤发生和抗肿瘤免疫有关(三–5)人类蜇伤常染色体显性遗传性功能获得突变可导致一种严重的自炎性综合征，称为螫刺相关血管病，发病于婴儿期（SAVI）(12,13)在人类和小鼠模型中的各种研究已经表明，针刺与多种炎症或自身免疫性疾病有广泛的联系(4,5)这些研究提出了一个关键的问题，即微调尾刺激活和信号传导的机制，特别是叮咬的负调控因子。

已经确定了几种机制对叮咬负性调节(2–5)NLR蛋白NLRX1和NLRC3以及ER定位的Ca^二+传感器STIM1（基质相互作用分子1）通过与STING的相互作用抑制STING激活(14–16)STING蛋白的翻译后修饰也可以负调控STING激活和信号传导。激酶ULK1[不协调表型基因51（unc-51）样激酶1；也叫ATG1（自噬相关1）]和磷酸酶PPM1A（蛋白磷酸酶，Mg）^二+/锰^二+依赖1A）和PTPN1/2（蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型和2型）通过调节刺激性磷酸化来抑制刺激性刺激(17–19)E3泛素连接酶-无名指蛋白（RNF）5（RNF5）、含有29的三重基序（TRIM29）和TRIM30a促进了刺的降解，而Deubiquitin泛素特异性肽酶（USP）13（USP13）和USP21阻碍了刺信号体的形成(20–25)对于泛素化的螫刺，泛素结合选择性自噬受体p62（也叫SQSTM1）通过自噬途径指导刺的降解(26)此外，代谢物硝基脂肪酸通过破坏刺的棕榈酰化来抑制刺的激活(27)在这些研究中，E3泛素连接酶或Deubiquitinas对STING泛素化的调节是一种重要的负性机制，而一些E3泛素连接酶如自分泌运动因子受体（AMFR）、TRIM32、TRIM56、RNF26和RNF218，与泛素化螫刺和促进刺激活有关(28–32)因此，鉴定先前未知的E3泛素连接酶和未知的泛素化类型对于正确和准确地控制刺的稳定性和激活是非常重要的。

大多数TRIM家族蛋白被定义为E3泛素连接酶，其特征是一个N端环指结构域、一个或两个锌指结构域（B1和/或B2盒）、一个螺旋线圈区和多种C-末端结构域(33)TRIM13[也叫ret finger protein 2（RFP2）]是一种独特的跨膜内质网定位的E3，与内质网应激、内质网相关降解（ERAD）和自噬有关(34–38)在先天性炎症反应领域，TRIM13抑制肿瘤坏死因子（TNF）诱导的NF-κB激活和先天性抗RNA病毒反应，但增强TLR2引发的固有反应(39–41)在这里，我们为TRIM13在致病性DNA引发的炎症反应中的负作用提供了遗传学和体内证据。TRIM13缺乏导致老年小鼠的自身炎症。我们的研究提供了新的机械观点来控制刺的内稳态，并说明了TRIM13是一个负的调节器，针刺相关的炎症。

结果

TRIM13抑制DNA引发的炎症反应

我们之前已经开始筛选参与免疫反应的关键E3泛素连接酶[基因表达总括（GEO），登录号GSE72077](42)。在RAW264中。水疱性口炎病毒和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染前后7个巨噬细胞的mRNA表达水平装饰件13得到了充分的表达。在基因数据库BioGPS中，人类装饰件13mRNA在睾丸和结肠组织以及血细胞中高表达，而小鼠则相反装饰件13mRNA在许多组织和细胞中广泛表达（尤其是巨噬细胞）。在地理数据库中装饰件13mRNA表达谱，装饰件13感染H1N1流感病毒（GDS5409）、结核杆菌（GDS4256和GDS5819）后，mRNA显著上调或下调，单核细胞增生李斯特菌（GDS5605），肺炎衣原体（GDS2651）或革兰氏阳性菌（GDS651）或革兰氏阳性菌（GDS5819），在紫外线（GDS400）、电离辐射（GDS1544）或热应激（GDS3004）或过敏（GDS3082）、系统性红斑狼疮（SLE；GDS4889、GDS4990和GDS4719）、家族性高胆固醇血症和动脉粥样硬化（GDS3668）的条件下，银屑病（GDS4602）、多发性硬化症（MS；GDS4218和GDS3920）或心力衰竭（GDS3115）。这些数据表明装饰件13可能与炎症和自身免疫反应有关。

当我们在研究TRIM13在先天性免疫反应中的作用时，有报道称TRIM13与TNF-和TLR2启动的反应以及先天性抗RNA病毒反应有关(39–41)在这项研究中，我们关注于DNA引发的先天性反应。在小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）和骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中，装饰件13HSV-1感染后，mRNA表达上调，同时诱导HSV-1的表达国际单项体育联合会和白细胞介素6mRNAs（图S1、A和B）。然后我们沉默了经前综合症和人HeLa细胞中TRIM13的表达（图S1，C和D）。虽然这三种小干扰rna（siRNAs）都适用于小鼠或人类装饰件13HSV-1、3sirna对炎症细胞因子的诱导作用增强装饰件13可以最有效地促进HSV-1诱导的细胞因子（图S1，E和F），因此被用于进一步的实验。我们发现，TRIM13敲除增强了HSV-1感染后或经多聚（dA:dT）[聚脱氧腺嘌呤脱氧核糖核酸（pdAT）]治疗后IFNβ、TNF和IL-6（白细胞介素-6）的诱导，并在PMs中合成了cGAMP（图S1，G到J）。在人HeLa细胞中，通过HSV-1感染和转染poly（dA:dT）和cGAMP（图S1，K到M），TRIM13的敲除也增强了炎症细胞因子的诱导白细胞介素10和转化生长因子B在装饰件13-沉默或装饰件13-HSV-1感染后PMs衰竭（图S1N）。在RAW264中。7巨噬细胞，TRIM13过度表达减少了炎症细胞因子的诱导（图S2，A到E）。因此，TRIM13可以抑制致病性DNA和cGAMP引发的炎症反应。

此前，E3泛素连接酶RNF5、TRIM29和TRIM30a已被确定为一种通过促进螫刺降解的负调节因子(20–23)所以，我们比较了装饰件13击倒致病性DNA-引发炎症反应Rnf5型,装饰件29，和Trim30a型击倒。在巨噬细胞中装饰件13很丰富，加上Rnf5型和Trim30a型，同时装饰件29低表达（图S3A）。在击倒Rnf5型,装饰件29，和Trim30a型在PMs（图S3B）中，我们发现国际单项体育联合会和白细胞介素6HSV-1感染在不同程度上明显增加，类似于HSV-1的作用装饰件13击倒（图S3C）。这些初步数据促使我们进一步研究TRIM13在先天性抗DNA反应中的作用。

TRIM13缺乏会加剧DNA引发的炎症反应

为了验证TRIM13在调节病原体来源DNA的固有反应中的作用，我们建立了装饰件13^?/?通过重组删除装饰件13在两端插入LoxP序列，用EIIA-Cre小鼠（完全敲除）培育小鼠。在装饰件13^?/?PMs和BMDMs中，我们发现HSV-1感染和转染poly（dA:dT）和cGAMP诱导的炎性细胞因子水平均显著升高装饰件13^+/+巨噬细胞(图1，A至H).英寸装饰件13^?/?野生型（WT）TRIM13的过度表达可以挽救BMDMs、IFNβ、TNF和IL-6的产生，但没有E3连接酶活性的TRIM13不能挽救BMDMs的产生¹⁰Cys和Cys¹³环结构域进入Ala（TRIM13-CA）；图1，I和J]表明炎症反应增强装饰件13^?/?BMDMs是由于TRIM13缺乏所致，可能与TRIM13的E3连接酶活性有关。这些数据表明TRIM13对抑制病原体dna的炎症反应是必需的。

图1TRIM13缺乏可增强对DNA和cGAMP的炎症反应。

(A到H)PMs（A到D）和BMDMs（E到H）被HSV-1感染[感染多重性（MOI）=5]，或者按照指示用cGAMP（5μg/ml）或poly（dA:dT）（5μg/ml）治疗（A到C和E到g）或8小时（D和H）。定量聚合酶链反应（qPCR）检测细胞因子mRNA水平（A～C和E～G），酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中细胞因子的表达（D和H）。(我和J)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?用mock、TRIM13或TRIM13-CA（CA）载体转染BMDMs 48小时。用免疫印迹法（I）检测TRIM13的表达。感染HSV-1（MOI=5）或cGAMP（5μg/ml）或聚（dA:dT）（5μg/ml）处理8h后，用ELISA（J）法测定上清液中的细胞因子。结果以平均数±SE[A到H和J；单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni多重比较]的形式呈现(n=3；三只WT或KO小鼠）。给出了三个典型实验中的一个。ns，不重要*Ptrans data-src=" 0.05, **"小于0.05**Ptrans data-src=" 0.01, ***"<0.01***Ptrans data-src=" 0.001, and ****"<0.001，以及****Ptrans data-src=" 0.0001."<0.0001。

确认装饰件13^?/?BMDMs对其他致病性dna进行转染，在化疗药物（地塞米松、丝裂霉素C和顺铂）治疗后，我们转染了来自自体胸腺细胞和B16黑色素瘤细胞的基因组dna。我们发现，这些自体DNA可诱导炎性细胞因子的产生，而TRIM13缺乏显著增强了反应（图S4），表明TRIM13是自体致病性DNA触发反应和病原体衍生DNA触发炎症反应的负调节因子。

TRIM13缺乏促进先天性抗DNA病毒反应

然后我们测试了TRIM13是否在DNA病毒HSV-1的先天反应中起重要作用。我们腹腔注射亚致死剂量的HSV-1[2×10]⁸每只老鼠的斑块形成单位（PFU）]。我们发现，大鼠血清中IFNβ、TNF和IL-6含量显著增加装饰件13^?/?小鼠肝脏、脾脏和肺中HSV-1的负荷显著降低(图2，A至E)对HSV-1感染后24小时肺组织进行组织学检查，发现炎性细胞浸润于肺内装饰件13^?/?小鼠明显增强(图2，F和G)经CD45计数进一步证实⁺支气管肺泡灌洗液中的免疫细胞(图2H)当静脉注射HSV-1病毒时，我们发现HSV-1在大脑中的复制在装饰件13^?/?老鼠(图2，I和J)为了评价TRIM13缺失对宿主DNA病毒感染的保护作用，我们腹腔注射致死剂量的HSV-1（5×10）⁸每只老鼠的PFUs）。我们发现装饰件13^?/?小鼠明显改善(图2K)提示TRIM13对抑制DNA病毒侵袭的炎症反应和限制宿主的保护作用是必需的。

图2.TRIM13缺乏促进体内固有的抗DNA病毒反应。

(A到H)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?老鼠(n=8只小鼠）腹腔注射100μl磷酸盐缓冲液（PBS）或含有2×10的PBS⁸HSV-1的PFUs。12小时后，用ELISA法（A～C）测定血清细胞因子水平。或者，在病原体感染后24小时，组织中的HSV-1滴度(n=8只小鼠）被测定（D和E）。用苏木精-伊红（H&E）染色（F）或免疫荧光显微镜检测CD45⁺免疫细胞（G）。从BALFs中提取CD45细胞⁺细胞计数法（FACS，fluoresculation activated cell sorting，H）。(我和J)老鼠(n=8）静脉注射100μl PBS，含2×10⁸HSV-1的PFUs。治疗72小时后，观察HSV-1在脑内的复制情况。(K)老鼠(n=10）腹腔注射100μl含5×10的PBS⁸HSV-1的PFUs。结果以平均值±标准差表示（A至E和H至J；未配对学生的t测试）。给出了三个典型实验中的一个**Ptrans data-src=" 0.01, ***"<0.01***Ptrans data-src=" 0.001, and ****"<0.001，以及****Ptrans data-src=" 0.0001."<0.0001。

TRIM13缺陷增强DNA病毒触发的NF-κB和IRF3的激活

为了探讨TRIM13对先天性抗DNA病毒反应的信号转导机制，我们检测了BMDMs感染HSV-1和VACV（痘苗病毒）后诱导炎症细胞因子的信号介质的激活。我们发现，TRIM13缺乏增强了TBK1、IRF3、IκBα（NF-κBα的抑制剂）和p65（也叫RelA）的磷酸化，但没有增强ERK1/2（细胞外信号调节激酶1/2）、JNK1/2（c-Jun N N-末端激酶1/2）和p38的磷酸化(图3，A和B，以及图S5，A和B）。同时，我们发现p65和IRF3的核转位以及IRF3的二聚体在细胞内的表达增强装饰件13^?/?BMDM系统(图3，C至F，以及图S5、C和D）。这些数据表明，TRIM13缺乏促进了DNA病毒触发的TBK1-IRF3和NF-κB途径的激活。

图3.TRIM13是抑制TBK1-IRF3和NF-κB信号通路激活所必需的。

(A到F)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?如图所示，BMDM感染了HSV-1（MOI=5）或VACV（MOI=5）。用Western印迹法检测全细胞提取物（WCE）（A和B）以及核和胞浆提取物（C和D）中的信号介质。另外，在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中分离非变性裂解产物，然后用免疫印迹法检测IRF3（E和F）。(G到我)人胚肾（HEK）293T细胞被模拟、刺激、标记标记的TRIM13（100、200、300或400 ng）或TRIM13突变体（TRIM13）转染-?TM或TRIM13-CA）载体和指示报告载体。48小时后，用或不加cGAMP（5μg/ml）处理细胞8h，测定荧光素酶活性(n=每组4个生物样本）。结果（G到I）表示为均值±SD（单向方差分析，然后是Bonferroni多重比较）。给出了三个典型实验中的一个**Ptrans data-src=" 0.01, ***"<0.01***Ptrans data-src=" 0.001, and ****"<0.001，以及****Ptrans data-src=" 0.0001."<0.0001。

由于TRIM13负性调节cGAMP触发的细胞因子，因此我们用荧光素酶报告物检测了TRIM13对刺激诱导的IRF3和NF-κB活化的影响。我们发现TRIM13的过度表达抑制了STING和cGAMP诱导的国际单项体育联合会和NF-κB报告员(图3，G和H)而TBK1-和IRF3诱导了国际单项体育联合会TBK1-、IKKβ（IκB激酶β）和p65-诱导的NF-κB报告员激活也未受到影响（图S5，E至H）。当STING与无跨膜结构域的TRIM13共转染时（TM；TRIM13的1～315个氨基酸，称为TRIM13）-?我们发现，这两个突变体都不能抑制cGAMP诱导的细胞凋亡国际单项体育联合会和NF-κB报告员(图3I)这些数据表明，TRIM13抑制TBK1-IRF3和NF-κB通路的激活。

TRIM13通过TM与STING相互作用

为了阐明TRIM13介导的先天性反应调节的分子机制，我们最初（没有意识到TRIM13与STING的关联）在TRIM13过度表达和免疫沉淀（IP）后，通过液相色谱（LC）质谱（ms）在人胚肾（HEK）293T细胞中检测了TRIM13的伴侣。我们发现TRIM13与丰富的内质网相关蛋白和其他囊泡蛋白有关（表S1）。然而，由于所使用的HEK293T细胞模型中没有STING，因此未检测到STING。在WT-BMDMs中，我们发现内源性TRIM13可以在静息状态下与螫刺相互作用，而这种相互作用在HSV-1感染后减弱(图4A)。在刺不足的RAW264中。7细胞，我们发现过度表达的TRIM13不能再结合TBK1和IRF3(图4B)表明TRIM13可能通过尾刺与TBK1和IRF3相互作用。

图4.TRIM13通过其TMs与STING交互。

(A和B)WT BMDMs（A）或刺^?/?RAW264。7个细胞（B）感染HSV-1（MOI=5）。用抗TRIM13抗体（A）或抗标记抗体（B）诱导IP后，用Western印迹法检测复合物中的组分。(C到E)RAW264。用绿色荧光蛋白（GFP）标记的STING或红色荧光蛋白（RFP）标记的TRIM13瞬时转染7个细胞（C和D）或HeLa细胞（C和E），然后分别感染或不感染HSV-1。然后用共聚焦显微镜（C到E）检查细胞。比例尺，10μm(F)全长（FL）域示意图或TRIM13旗或STING Myc片段。数字表示氨基酸的位置。(G和H)用Flag标记的TRIM13（或突变体）和Myc标记的STING（或突变体）瞬时转染HEK293T细胞48小时。用抗旗琼脂糖微球（G）或抗Myc琼脂糖微球（H）免疫沉淀WCE，用Western印迹法检测相关的STING或TRIM13蛋白。给出了三个典型实验中的一个。

接下来，我们研究了TRIM13在RAW264中的本地化。7个细胞。我们发现TRIM13与ER蛋白（KDEL染色）共定位，但没有与内体[EEA1（早期内切体抗原1）]、线粒体[TOM20（外膜转位酶20）]和高尔基体（高尔基58K染色）蛋白质共定位(图4C以及图S6，A和B）。在两个RAW264中。7个细胞和HeLa细胞，感染HSV-1后，TRIM13大部分仍留在ER中(图4C)在被细菌CDNs或cGAMP激活后，STING离开ER，通过ERGIC转运到高尔基体进行活化或最终降解(2–5)。在两个RAW264中。在HeLa细胞中，TRIM13在静息状态下与STING共定位(图4，D和E)感染HSV-1后，TRIM13与蜇伤的共定位作用减弱(图4，D和E与图4c）中观察到的IP一致(图4A)因此，TRIM13与ER膜上的刺一起共定位，而DNA病毒感染并没有从根本上改变TRIM13的定位。

STING的N端含有4个TM片段（tms1～4），C端含有一个二聚结构域、一个CDN结合区（CBD）和一个C末端尾部（CTT）(2–5)而TRIM13的N端含有三个保守结构域环（R）、B盒（B）和螺旋线圈（CC），C端有一个TM(图4F) (33)我们确定了STING和TRIM13中的哪个域负责相互作用。全长TRIM13可与全长（FL）或尾管TM（#1）结合，但没有TM（#2）的刺不能结合(图4G)同时，全长刺可与全长TRIM13或无环结构域的TRIM13结合，但不能与无TM的TRIM13结合（#2）或只有环畴的TRIM13结合(图4H)当共焦显微镜检查时，TRIM13和没有TM的STING不能共定位（图S6B）。这些数据表明TRIM13和STING通过TMs相互作用。

TRIM13催化赖氨酸⁶赖氨酸刺激的连锁¹⁹

由于TRIM13是一种E3泛素连接酶，我们研究了TRIM13对STING泛素化的影响，以解决TRIM13抑制STING信号传导的分子机制。两者兼而有之装饰件13^+/+和装饰件13^?/?BMDMs，赖氨酸⁴⁸-还有赖氨酸⁶³-DNA病毒感染（HSV-1和VACV）后，刺的连锁多泛素化不受影响(图5，A和B)然而，总的来说，刺的多泛素化减少了装饰件13^?/?DNA病毒感染后的BMDMs(图5C)此外，在HEK293T细胞中，TRIM13的过表达增强了外源性表达的STING的多泛素化，而没有E3连接酶活性（TRIM13-CA）的TRIM13未能对STING进行多泛素化(图5D)表明TRIM13依赖于其E3连接酶的活性来催化STING多泛素化。

图5.TRIM13催化赖氨酸⁶-Lys刺激的连锁多泛素化¹⁹.

(A到C)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?用HSV-1（MOI=5）或VACV（MOI=5）感染BMDMs细胞4小时。用抗蜇伤抗体加蛋白A/G微球免疫沉淀WCE。用抗K48泛素（Ub）（A）、抗k63ub进行Western印迹检测(B)或抗Ub（C）抗体。(D)将标记的TRIM13（FL）或TRIM13-CA（CA）与Myc标记的STING载体一起瞬时转染HEK293T细胞48小时。然后，用抗Myc-Sepharose微珠免疫印迹法检测针刺后的多泛素化。(E)如图所示，用Flag标记的TRIM13、Myc标记的STING和血凝素（HA）标记的Ub（突变体）载体瞬时转染HEK293T细胞48小时。然后，用Western印迹法检测免疫沉淀刺的多泛素化。(F)如图所示，用Flag标记的TRIM13、Myc标记的STING（突变体）和HA标记的Ub载体瞬时转染HEK293T细胞48小时。然后，用Western印迹法检测免疫沉淀刺的多泛素化。给出了三个典型实验中的一个。

在HEK293T细胞中过度表达TRIM13、STING和WT或突变泛素（Ub；仅指示Lys残基不变；图S7A）后，我们发现STING与Lys相关⁶-只有泛素突变体（Ub#1；图5E)表明TRIM13催化了Lys⁶刺的连接。为了鉴定TRIM13修饰的小鼠螫伤中的Lys残基，我们将12个Lys残基逐一突变为Arg（图S7B）。在HEK293T细胞中，我们发现Lys¹⁹由于TRIM13未能将该残基突变为Arg（STING-K19R，#1），因此在刺的N端（在第一个TM之前）残基是TRIM13的泛素连锁位点(图5F).

确认Lys的意义¹⁹在由DNA引发的固有反应中，我们重新表达了STING和STING-K19R突变体刺痛^?/?RAW264。7个电池（图S8A）。我们发现，WT-STING可以抑制IFNβ和IL-6的产生刺^?/?RAW264。7由HSV-1感染诱导的细胞，而STING-K19R增加了细胞因子的产生（图S8、B和C），这可能是因为STING-K19R中的持续性STING水平刺^?/?RAW264。感染HSV-1后的7个细胞（图S8、D和E）。此外，我们发现STING-K19R被救了刺^?/?RAW264。7个细胞即使在TRIM13过度表达的情况下也能增加IFNβ和IL-6的产生（图S8，F到H）。这些数据表明TRIM13多泛素对Lys有毒害作用¹⁹作为一种负性机制来调节对DNA病毒的固有反应。

TRIM13缺陷加速了ER中刺的去除

以上数据表明TRIM13与STING相互作用并产生多泛素。根据现有的螫刺激活和终止模型，刺在CDN结合后二聚化，然后离开内质网进入高尔基体，并进入高尔基体后小泡，进行刺信号体组装或自噬和自噬降解(2–5,43–45)考虑到第13条的退化，我们考虑到第13条的退化。

我们检测了HSV-1或VACV感染后的STING二聚体。我们发现TRIM13缺乏增强了BMDMs中STING的二聚化(图6，A和B)为了研究TRIM13对尾刺内质网出口的影响，我们从装饰件13^+/+和装饰件13^?/?并检测了DNA病毒感染后ER内的叮咬量。我们发现HSV-1或VACV感染触发了内质网刺痛的去除，而TRIM13缺乏加速了这一过程(图6，C和D，以及图S9、A和B），表明TRIM13可延迟从ER中移除尾撑。在装饰件13^?/?小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）感染后，我们还观察到HSV-1感染后，ER刺激物的清除速度加快(图6E以及图S9C）。

图6.TRIM13抑制STING二聚并减慢STING的ER出口。

(A和B)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?如图所示，BMDM感染了HSV-1（MOI=5）或VACV（MOI=5）。然后，将未变性的裂解物用天然聚丙烯酰胺凝胶分离，然后用Western blotting检测是否有刺痛。(C到E)ER提取物装饰件13^+/+或装饰件13^?/?用免疫印迹法检测感染HSV-1（MOI=5）或VACV（MOI=5）的BMDMs（C和D）或MEFs（E）。(F和G)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?用mock或TRIM13-ΔTM载体转染BMDMs 48小时，然后在15μM MG132（F）或20μM氯喹（CLQ）（G）存在下感染HSV-1。免疫印迹法检测内质网提取物。(H和我)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?BMDMs（H）或MEFs（I）感染HSV-1 2小时。然后，用共聚焦显微镜观察了KDEL对针刺的共定位作用。比例尺，10μm。展示了三个代表性实验中的一个。

为了区分从急诊室的急诊室装饰件13^?/?BMDMs并不是因为总的STING降解，我们在蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下检查了BMDMs中ER相关的STING，该抑制剂已被证明可以逆转几种E3连接酶诱导的STING降解(20–23)我们发现了装饰件13^?/?BMDMs仍能加速去除ER中的刺(图6F以及图S9D）。当装饰件13^?/?用无TM的TRIM13解救BMDMs（TRIM13-ΔTM），无法恢复尾刺的清除动态(图6F以及图S9D）。先前的研究表明，螫伤的自噬、自噬或溶酶体降解是尾刺降解的终止模块(2–5,43–45)因此，我们进一步用氯喹（CLQ）来阻断溶酶体末端的STING降解(43–45).在CLQ在场的情况下，装饰件13^?/?BMDMs仍然显示ER中的尾刺水平加速下降(图6G以及图S9E）。这些数据表明，在TRIM13缺陷细胞中，STING从ER中被加速清除可能不仅仅是由于STING降解，而且可能是由于STING的ER退出增强所致。

为了进一步验证ER延迟退出STING，我们使用BMDMs和MEFs进行了共定位分析。在装饰件13^?/?细胞，HSV-1感染后，与ER标记物KDEL的共定位在2小时内减少得更快，而总的STING减少最少(43,44)，与装饰件13^+/+细胞(图6，H和I，以及图S9、F和G）。这些数据共同表明，TRIM13可能会减缓尾刺的内质网出口，类似于跨膜尾刺调节器STIM1和TMEM203的报道(16,46).

尾撑退化需要TRIM13

然后我们确定了TRIM13的E3连接酶活性在抑制蜇伤中的作用。在RAW264中。7细胞中，TRIM13的过度表达加速了STING的降解，而TRIM13-CA不能(图7A以及图S10A）。在装饰件13^?/?BMDMs和MEFs，我们发现总的叮咬量增加，这不能被TRIM13-CA过度表达所拯救(图7、B和C，以及图S10、B和C）。为了进一步证实TRIM13在STING降解中的作用，我们对BMDMs中的STING蛋白进行了环己酰亚胺（CHX）chase分析。我们发现，TRIM13缺乏并不影响未感染HSV-1的CHX处理的BMDMs的螫刺降解(图7D和图S10D），而在CHX预处理中，尾刺的降解延迟装饰件13^?/?HSV-1感染后的BMDMs(图7E以及图S10E）。这些数据表明，TRIM13是DNA病毒诱导的螫刺降解所必需的。

图7.TRIM13促进刺的降解。

(A)RAW264。7个细胞被转染48小时。感染HSV-1后，Western blotting（A）检测WCE中的螫伤水平。(B和C)BMDMs（B）或MEFs（C）分别转染或不转染mock或TRIM13-CA载体48小时。用Western印迹法检测针刺水平。(D和E)用Western印迹法检测BMDMs在CHX（20μM）（D）存在下或经CHX预处理1小时（E）后的STING降解情况。(F和G)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?BMDMs（F）或RAW264。用mock或TRIM13标记载体转染7个细胞48h（G），在有无20μM ESI的情况下感染HSV-1，Western blotting检测WCE中的STING。(H到J)RAW264。7细胞转染mock或TRIM13标记载体48小时（H和J）或装饰件13^+/+或装饰件13^?/?用对照（Ctrl）siRNAs或p62特异性sirna转染BMDMs（H和I）48h。用免疫印迹法（H）评价p62基因敲除的效率。westernblotting（I和J）检测WCE中的螫刺。给出了三个典型实验中的一个。

由于TRIM13在内质网中持续定位，因此TRIM13可能通过内质网引发的降解来调节尾撑的降解(47,48)这可能不同于能量启动的自噬途径和后ER启动的自噬途径(43–45)鉴于TRIM13与L型钙通道的ERAD和T细胞受体CD3δ链有关(35,36)研究了ERAD抑制剂Eeyarestatin I（ESI）对尾刺降解的影响。电喷雾处理装饰件13^+/+BMDMs的降解动力学与装饰件13^?/?细胞未经ESI处理，而ESI处理改善了两者之间的差异装饰件13^+/+和装饰件13^?/?BMDMs在毒刺降解中的作用(图7F以及图S10F）。此外，ESI处理阻断了TRIM13过度表达诱导的RAW264中的刺降解增强。7个电池(图7G以及图S10G）。因此，TRIM13主要通过ERAD途径促进螫伤的降解。

另一种自噬性降解被称为噬菌体降解。TRIM13被认为是p62的泛素依赖性内质网吞噬受体(37)因此，TRIM13有可能促进蜇伤的内质网吞噬降解(49)。我们在BMDMs和RAW264中击落了p62。7个电池(图7H).装饰件13^+/+p62基因敲除的BMDMs的降解动力学与装饰件13^?/?没有p62敲除的BMDMs，而p62敲除的BMDMs改善了两者之间的差异装饰件13^+/+和装饰件13^?/?BMDMs在毒刺降解中的作用(图7I图S10H）。此外，p62基因敲除不能逆转TRIM13过表达诱导的螫伤降解(图7J以及图S10I）。这些数据表明，内质网吞噬可能调节螫伤的降解，而TRIM13主要通过ERAD途径促进螫伤的降解。

TRIM13缺陷增强的抗DNA固有反应需要刺激

为了验证STING在TRIM13诱导的抑制DNA引发的炎症反应中的作用，我们沉默了STING的表达(图8A)或用共价小分子抑制剂C-176抑制STING的激活(50)，英寸装饰件13^?/?BMDM系统。我们发现，STING基因敲除和C-176都能挽救DNA病毒增加的IFNβ和IL-6的产生(图8，B至I)这表明，TRIM13缺陷导致的细胞因子产生增加是必需的。

图8对TRIM13缺陷诱导的固有抗DNA反应增强是必需的。

(A到我)BMDM系统(n=3只小鼠）转染siRNAs 48小时（A至E），并在存在或不存在1μM C-176（F至I）的情况下感染病毒8小时（B至E）。ELISA法检测细胞因子。(J到O)用HSV-1感染BMDMs（J）8h后，用ELISA法检测细胞因子（K和L）(n=3只老鼠）。12小时后，腹腔注射HSV-1（2×10）后⁸用ELISA法测定血清细胞因子（M和N）。感染后24小时，测定肺内HSV-1滴度（O）。(P)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?老鼠(n=6）每天用或不加300 nmol C-176预处理2天。HSV-1感染后24小时（2×10⁸测定肺组织HSV-1滴度。结果（B到I和K到P）表示为均值±SD（单向方差分析，然后是Bonferroni多重比较）。给出了三个典型实验中的一个**Ptrans data-src=" 0.01, ***"<0.01***Ptrans data-src=" 0.001, and ****"<0.001和****Ptrans data-src=" 0.0001."<0.0001。

为了更具体地阐明蜇伤在TRIM13缺失中的作用-增强对致病性DNA的固有反应，我们制备了双敲除（DKO；装饰件13^?/?刺^?/?)小鼠繁殖装饰件13^?/?带老鼠的刺^?/?老鼠。在用HSV-1感染治疗的BMDMs中，我们发现DKO细胞(图8J)其IFNβ和IL-6水平与正常人相似刺^?/?BMDM系统(图8，K和L)此外，我们还发现小鼠血清中IL-6和IL-6水平相似刺^?/?小鼠感染HSV-1后(图8，M和N)DKO小鼠肺内病毒滴度与DKO小鼠肺组织病毒滴度无明显差异刺^?/?老鼠(图8O)小鼠经针刺抑制剂C-176预处理后，肺组织中病毒滴度下降装饰件13^?/?老鼠和装饰件13^+/+老鼠(图8P)这些数据证实，TRIM13缺陷引起的先天性抗DNA病毒反应增强需要针刺。

TRIM13缺乏导致小鼠年龄相关的自身炎症

针刺的异常激活与人类和小鼠的自身炎症或自身免疫性疾病有关(12,13)而STIM1、TMEM203和C9ORF72等相互作用蛋白的突变与自身炎症和自身免疫性疾病有关(16,46,51)因此，我们想知道TRIM13缺乏是否也会引起小鼠的自炎症状。肺、肝、肾、心、脑等脏器组织学检查未见明显炎症征象装饰件13^?/?5个月大的小鼠(图9，A和B，以及图S11，A至E）。然而，10个月大的孩子装饰件13^?/?小鼠在肺、肝、肾有广泛的炎性细胞浸润，心、脑有轻度炎性细胞浸润(图9，A和B，以及图S11，A至E）。八个人中装饰件13^?/?苏木精-伊红（H&E）染色检查，7只小鼠（87.5%）在肺（支气管或血管周围），6只（75.0%）在肾脏，4只（50.0%）在肝脏，1只（12.5%）在大脑，1只小鼠（12.5%）在心脏发现浸润的炎性细胞。相应的，10月龄大鼠血清中IFNβ和IL-6的含量也相应升高装饰件13^?/?小鼠明显增加(图9C)定量聚合酶链反应（qPCR）检测国际单项体育联合会和白细胞介素6在它们的肺，肝脏和肾脏里装饰件13^?/?小鼠也表现出炎性细胞因子的增加（图S11，F和G）。这些数据表明，TRIM13缺乏可导致年龄相关的自身炎症。

图9.TRIM13缺陷小鼠表现出与年龄相关的自身炎症。

(A和B)装饰件13^+/+或装饰件13^?/?用H&E染色法（A）检测小鼠。n=8只小鼠）计数（B）。(C)10月龄小鼠血清细胞因子的研究(n=8）用酶联免疫吸附测定。(D到F)10个月大的组织装饰件13^+/+（D） 或者装饰件13^?/?对小鼠（D至F）进行免疫细胞标记物[CD45]染色⁺用免疫荧光显微镜。15个炎性病灶的免疫细胞群(n=15），计算一张幻灯片（F）。(G和H)10个月大的孩子装饰件13^?/?老鼠(n=6）每天用或不加300 nmol C-176预处理10天。ELISA法测定血清IFNβ、IL-6水平。肺组织细胞因子mRNA水平用qPCR（H）定量。结果以平均值±标准差（B、C和F至H）表示。[在（B）中，是单向方差分析，然后是Bonferroni多重比较；在（C）、（G）和H中，是未配对学生的t测试]。给出了三个典型实验中的一个*Ptrans data-src=" 0.05, **"小于0.05**Ptrans data-src=" 0.01, ***"<0.01***Ptrans data-src=" 0.001, and ****"<0.001，以及****Ptrans data-src=" 0.0001."<0.0001。

CD45染色免疫荧光显微镜检查⁺10月龄小鼠肺、肝、肾的免疫细胞证实，所观察到的炎性细胞灶由免疫细胞组成(图9D)然后我们进一步鉴定了10个月大的婴儿的免疫细胞装饰件13^?/?用免疫荧光显微镜观察小鼠免疫细胞标志物。我们发现炎性细胞灶内的细胞主要由CD4组成⁺和CD14⁺细胞；在较小程度上，CD8⁺细胞；而且，至少是F4/80⁺或Ly6G⁺细胞(图9，E和F)然而，TRIM13缺乏并不影响外周血中白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量（图S12A）。此外，10月龄大鼠脾脏的重量和主要免疫细胞群也有不同程度的变化装饰件13^?/?与对照组相比，小鼠没有明显变化装饰件13^+/+同龄小鼠（图S12，B至D）。这些数据表明，TRIM13缺陷引发的自身炎症可能是由于炎性髓细胞和CD4浸润增加所致⁺T细胞。

如所示图9E在10个月龄的炎性病灶中，大部分细胞为阳性装饰件13^?/?小白鼠被刺伤的颜色很亮，这表明组织中的刺痛水平可能会增加。因此，我们检查了10个月大婴儿的肺组织装饰件13^+/+和装饰件13^?/?STING小鼠、Caspase 8、MDA-5（黑色素瘤分化相关基因5）和NEMO（NF-κB基本调节因子）均被认为是TRIM13的底物(1,38–40)尽管在肺中刺痛的程度增加了装饰件13^?/?小鼠，TRIM13缺乏并不影响其他潜在底物的水平（图S13，A和B），这表明在年龄相关的自身炎症过程中，刺可能是TRIM13的潜在靶点。此外，我们研究了观察到的自体炎症变化装饰件13^?/?小白鼠是因为刺激而引起的。当10个月大的时候装饰件13^?/?用针刺抑制剂C-176治疗小鼠，测定血清IFNβ和IL-6水平(图9G)以及国际单项体育联合会和白细胞介素6在肺部(图9H)都明显减少了。这些数据表明，TRIM13缺乏相关的自身炎症可能与刺激激活有关。

在公共数据库中，鼠标装饰件13巨噬细胞高表达mRNA。我们想知道组织内巨噬细胞表达的TRIM13是否可能与上述观察到的肺部年龄相关的自身炎症有关。肺泡巨噬细胞来源于肺泡巨噬细胞装饰件13^?/?小鼠，HSV-1感染或cGAMP治疗后炎性细胞因子的产生增强（图S13，C至E）。而刺痛程度在装饰件13^+/+和装饰件13^?/?AMs感染HSV-1前，刺的降解延迟装饰件13^?/?AMs（图S13，F和G），与BMDMs中的一致。然而，在AMs中，来自10个月大的BALF装饰件13^?/?小鼠，针刺水平增加（图S13，H和I），这可能表明TRIM13在刺激物（可能是当前与年龄相关的实验设置中的自身DNA，与8周龄小鼠的AMs相比）存在时对刺的降解产生负性调节。同时，炎性细胞因子和趋化因子的表达明显高于对照组装饰件13^?/?AMs（图S13J），可能与观察到的老年人肺部炎症细胞浸润有关装饰件13^?/?表明组织内的巨噬细胞可能是观察到的自身炎症的来源之一。

TRIM13缺乏增强双链DNA诱导的自身免疫反应

然后我们确定TRIM13缺乏是否能增加小鼠对自身免疫性疾病的敏感性。在地理数据库中，人类装饰件13外周血单核细胞和CD3的mRNA水平显著降低⁺SLE患者的T细胞(图10，A至C).对于MS患者装饰件13脑损伤和外周血单个核细胞（PBMCs）的mRNA水平也显著降低(图10，D和E)综上所述，在上述与年龄相关的自身炎症数据中，可以推断TRIM13可能有助于预防自身免疫性疾病。

图10TRIM13缺陷小鼠表现出增强的抗双链DNA（dsDNA）自身免疫反应。

(A到E)对来自地理数据库的数据进行了差异分析装饰件13mRNA表达。引用的数据集为GDS4889（A）、GDS4890（B）、GDS4719（C）、GDS4218（D）和GDS3920（E）。(F到我)10月龄儿童血清总免疫球蛋白M（IgM）（F）和IgG（G）及抗核抗原（ANA）（H）和dsDNA（I）自身抗体的自身抗体装饰件13^+/+或装饰件13^?/?老鼠(n=6只小鼠/组）用酶联免疫吸附法测定。(J)8周龄小鼠(n=6/组）免疫来自自体凋亡胸腺细胞的基因组DNA。第二次增强后7天，用ELISA法检测血清中抗dsDNA的自身抗体。结果以指示生物样品的平均值±标准差表示（A至I，未配对学生的t试验；J、 单因素方差分析和Bonferroni多重比较）。给出了三个典型实验中的一个*Ptrans data-src=" 0.05, **"小于0.05**Ptrans data-src=" 0.01, ***"小于0.01***Ptrans data-src=" 0.001, and ****"<0.001，以及****Ptrans data-src=" 0.0001."<0.0001。

在10个月龄的小鼠中，我们发现总免疫球蛋白G（IgG）和IgM的浓度，特别是抗核抗原（ANA）和双链DNA（dsDNA）的自身抗体水平明显高于对照组装饰件13^?/?比那年龄相配的老鼠装饰件13^+/+老鼠(图10，F至I)，说明老人装饰件13^?/?小鼠易患自身免疫性疾病。为了进一步探讨TRIM13在自身免疫中的作用，我们用来自自体凋亡胸腺细胞的dsDNA免疫8周龄小鼠。第二次强化免疫后7天，TRIM13完全敲除的小鼠体内，抗dsDNA的自身抗体水平显著升高（交叉装饰件13^{絮状物/絮状物}携带EIIA Cre小鼠的小鼠，被指定为装饰件13^?/?)在小鼠骨髓特异性TRIM13基因敲除（交叉装饰件13^{絮状物/絮状物}带有Lyz-Cre小鼠的小鼠，被指定为装饰件13-溶解酵素^?/?) (图10J)，而DKO小鼠装饰件13^?/?老鼠或装饰件13-溶解酵素^?/?带老鼠的刺^?/?小鼠）的血清抗dsDNA自身抗体量与刺^?/?老鼠(图10J)因此，TRIM13缺乏可能会增加宿主对自身免疫性疾病的敏感性，这可能需要存在刺痛。

讨论

我们的研究通过敲除模型证明了TRIM13在抑制致病性DNA刺激激活中的负作用。此外，我们发现TRIM13在调节针对致病性dna的先天免疫反应期间的STING内环境平衡至关重要。在TRIM13基因敲除小鼠中观察到的与年龄相关的自身炎症，支持了TRIM13在炎症性疾病中的重要作用的建议。

为预防自身炎症和自身免疫性疾病，应严格控制针刺的激活。STING编码基因功能获得突变的患者Tmem173型如V147L、N154S和V155M，表现为SAVI症状，主要表现为皮肤、粘膜和肺部炎症(12,13)在没有cGAMP的情况下，这些STING突变导致了来自ER的STING流量，并通过ERGIC和Golgi装置转运(52)携带小鼠螫伤的N153S或V154M突变的敲除小鼠肺和皮肤出现严重的血管周围炎症，这可能是由于髓样细胞扩张、T细胞减少、淋巴结器官发生和固有淋巴细胞发育中断引起的(2–5,13,53–58)在我们的研究中，TRIM13基因敲除小鼠在10个月大时表现出与年龄相关的自身炎症和自身免疫症状，这与针刺突变小鼠的早期自身炎症不同。在TRIM13基因敲除小鼠中观察到的症状部分类似于，但在涉及器官和发病年龄方面不如刺突突变小鼠严重(2–4,13,53–58)本研究尚未完全证实TRIM13空白老年小鼠的自身炎症是否由刺激引起。我们的研究提供了证据表明，在TRIM13缺乏症中，STING的关键作用是通过使用STING击倒、STING抑制剂C-176和DKO模型来增强对DNA病毒的固有炎症反应。STING基因敲除改善了自体DNA诱导的自身抗体的产生装饰件13^?/?小鼠可能进一步支持TRIM13和STING之间的功能联系。理想的证据可能是证实老年DKO小鼠出现逆转的自身炎症症状，由于耗时的实验，目前还没有获得这种症状，但在今后的研究中将引起我们的注意。另一方面，尚不清楚TRIM13缺乏引起的年龄相关性自身炎症是否依赖于I型干扰素或T细胞减少。10月龄脾脏免疫细胞表型的初步研究装饰件13^?/?小鼠可能表明，TRIM13可能不会严重影响主要免疫细胞群的数量，这与以往报道的刺突突变小鼠不同(2–5,13,53–58).未来使用基因敲除衰老小鼠，如STING、IRF3或IFNα受体敲除小鼠以及条件性T细胞特异性敲除小鼠的研究，可能有助于解决这一问题。如公共数据库所示，鼠螫伤在许多细胞中广泛表达，特别是在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和巨噬细胞中表达量高，而装饰件13mRNA在巨噬细胞中相对受限，而在T细胞和B细胞中的表达较低，这可能是针刺突变小鼠与老年TRIM13缺陷小鼠之间所观察到的不同症状的原因之一。老年AMs的实验数据表明，组织内的巨噬细胞可能是浸润炎性细胞的驱动因素，因为老年小鼠的自身DNA通常增加，而自体炎症的AMs中会诱导趋化因子装饰件13^?/?老鼠。另一种可能是装饰件13^?/?小鼠认为，TRIM13缺乏可能被其他负性刺激调节因子，如E3s和螫伤相关蛋白部分补偿(2–5,14–26,46,51)当小白鼠健康年幼时。相应地，健康成年小鼠和静息巨噬细胞的针刺水平在装饰件13^+/+和装饰件13^?/?基因型，而刺蛋白在老年性自身炎症中增加装饰件13^?/?小鼠，表明在致病性DNA刺激条件下，对TRIM13的刺内稳态有相对特定的需求。TRIM13是否参与T细胞（如T辅助细胞17细胞、先天性淋巴细胞等）和B细胞的发育或功能调节，有待于今后的深入研究。

STING是一种内质网相关的适配器，用于对致病性DNA的固有反应(2–5).CDN或cGAMP触发STING二聚，然后以COP-II（coat-protein complex II）囊泡和ERGIC的形式从ER中退出(2–5)一部分能相关的刺被分类为自噬体，而另一部分囊泡相关的刺继续转移到高尔基体和高尔基体后小泡，在那里形成了由刺、TBK1和IRF3组成的信号体(2–5,59)TBK1s的诱导和诱导导致的细胞因子的磷酸化(59,60)最近的研究也提出了干扰素非依赖性和转录非依赖性在抗病毒过程中的作用(45,61,62)沿着STING激活途径，已经发现了多种抑制STING信号传导的负机制。尾丝内质网退出是一个初始的速率限制步骤，在这一步中，STIM1被提议通过与尾丝TM的相互作用来延迟ER退出到ERGIC并抑制尾丝的二聚化(16).TRIM13是一种跨膜内质网相关分子，可以通过TM与STIM1-STING相互作用(16)因此，在我们的研究中，可以合理地发现TRIM13延缓了STING的ER退出，并抑制了STING的二聚。将来探索TRIM13能否与STIM1相互作用将是一个有趣的问题。内质网退出后，通过翻译后修饰或与STING的竞争性相互作用，在ERGIC、高尔基体和可能的内溶体中组装尾信号体是另一个受到严格控制的步骤(2–5,14,15,17,18,24,25)由于TRIM13可以延迟尾流退出尾流，并且本身是ER的组成部分，因此它可能不会直接影响尾流信号体的形成。STING的退化是终止STING信号最普遍也是最最终的反馈机制。ULK1和ATG9a可促进STING的自噬降解，p62则直接将泛素化的STING作用于自噬体(2–5,17,26,43–45).E3泛素连接酶RNF5、TRIM29和TRIM30a标记蛋白酶体降解(20–23)STING相互作用的伙伴TMEM203和C9ORF72通过促进溶酶体和自身溶酶体途径促进STING的降解(46,51)嗜酸性粒细胞也可能是潜在的毒刺降解途径(49)，这一点还不清楚。TRIM13促进DNA病毒感染后的螫伤降解，通过广泛的免疫印迹分析和使用装饰件13^?/?BMDMs和MEFs或TRIM13在巨噬细胞中过度表达。三聚体13在内质网中的稳定定位支持了内质网引发的降解的建议，这可能不同于能量引发的自噬体、自噬或溶酶体降解途径，因为这些途径需要内质网退出刺激。目前，ERAD和ER吞噬是已知的ER启动的蛋白质降解机制(47,48)我们的数据表明，TRIM13可能通过ERAD途径促进尾刺的降解，因为ERAD抑制剂ESI完全改善了两者之间的尾刺降解动力学差异装饰件13^+/+和装饰件13^?/?细胞以及模拟转染和TRIM13过度表达的细胞之间。尽管TRIM13与内质网吞噬过程有关(37)p62基因敲除不能完全逆转TRIM13对尾刺降解的影响。然而，p62广泛涉及多种蛋白质降解途径，包括但不限于自噬、自噬、溶酶体、蛋白酶体、内质网相关和内质网吞噬降解途径(47,48)因此，不能排除TRIM13也可能通过其他途径（尤其是ER吞噬）影响刺的降解，这可能需要除Western blotting外更精确的蛋白质定量技术。基于这些考虑，我们建议TRIM13通过调节内质网退出和螫伤降解来抑制与螫伤相关的对致病性DNA的固有反应。

E3连接酶和deubiquitinase能增加或去除不同类型的泛素链，调节刺的激活或稳定性。不同类型的多泛素化作用在不同的部位被发现，如赖氨酸⁴⁸连杆（Lys¹⁵⁰通过RNF5，Lys³⁷⁰TRIM29和Lys²⁷⁵TRIM30a），赖氨酸⁶³连杆（Lys¹⁵⁰通过TRIM56，Lys²²⁴MUL1和Lys^{20/150/224/236年}TRIM32），赖氨酸¹¹连杆（Lys¹⁵⁰通过RNF26）和Lys²⁷连杆（Lys^{137/150/224/236}AMFR提供）(2–5,20–23,28–32)但Lys⁶，赖氨酸²⁹，和赖氨酸³³刺多泛素化的类型尚未报道。我们的研究确定了一种以前未被确认的刺多泛素化类型，Lys⁶-泛素化。这种泛素化是否与ERAD相关或特异性尚不清楚，有待进一步研究。赖氨酸¹⁹（赖氨酸²⁰在人类）是第一个Lys残留在刺的第一个TM-之前。TRIM32催化赖氨酸⁶³-在这个残基上连接多泛素并促进与TBK1的相互作用(29).TRIM13催化赖氨酸⁶Lys上的连接¹⁹并引导尾刺降解，从而导致抑制的尾刺激活。TRIM13与RNF5结构相似，含有TM-，在巨噬细胞中均有丰富表达。RNF5可定位于内质网和线粒体，介导RNA病毒诱导的STING和MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白）的降解，但其在先天性抗DNA病毒中的作用尚未得到证实(20,63).RNF5也与STING的ERAD有关(64)此前，有报道称TRIM13可能通过MDA-5抑制RNA病毒诱导的炎症反应(40)。TRIM13是否通过ERAD调节抗RNA病毒的固有反应可能需要进一步的研究。因此，TRIM13催化了一种以前未被确认的刺多泛素化，这是一种控制螫刺激活的负机制。

综上所述，我们的研究为TRIM13在对致病性dna的反应中重新训练刺激激活的关键作用提供了遗传学证据。赖氨酸⁶-TRIM13对尾丝的多泛素化作用是尾丝降解的重要标志，为尾丝激活提供了潜在的刹车。对13岁自身免疫性疾病和自身免疫相关疾病的进一步探讨。

材料和方法

小鼠和细胞

所有动物实验均经上海第二军医大学科学调查委员会批准，按照国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。C57BL/6（H-2K^b)WT小鼠（6～8周龄）购自合资企业Sipper-BK实验动物（中国上海）。这个装饰件13采用基因重组的方法，通过替换基因外显子3，建立条件敲除小鼠装饰件13在上海模式生物中心公司（中国上海）的协助下，在两端插入LoxP序列(65,66)并与C57BL/6小鼠回交6代以上。这个装饰件13^{絮状物/絮状物}将小鼠与EIIA-Cre小鼠或Lyz-Cre小鼠杂交，产生完全敲除或髓系特异性敲除小鼠进行实验。C57BL/6N-Sting1^埃米亚根(刺^?/?老鼠；菌株编码KOCMP-72512-Sting1-B6N-VA）购自Cyagen（中国广东）。为了对小鼠进行基因分型，提取尾部DNA，并按说明进行PCR(65,66)基因分型引物序列和标准见表S2。

HeLa、HEK293T和RAW264。7个细胞从美国类型培养收集（ATCC；Manassas，VA）获得并通过鉴定，并按照供应商的建议进行培养。如前所述制备并培养PMs和BMDMs(42,65,66)为了从小鼠BALFs中分离AMs，在右心室注入10ml冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）三次肺灌注后，收集BALFs（每次1ml，共10次）。然后，在300℃离心获得BALFs中的细胞g在塑料皿上粘附2小时后10分钟，冲洗掉未粘附的细胞，其余贴壁细胞作为AMs[经FACS（荧光活化细胞分类）检测，90%以上的细胞为F4/80阳性]。为了消耗RAW264中的老鼠刺。将7个细胞，pc3-U6-guide RNA-CMV-RED（编码引导RNA和RFP）和Cas9-IRES-EGFP【编码Cas9和绿色荧光蛋白（GFP）】质粒（来自中国上海模型生物中心股份有限公司）共转染到RAW264中。7个电池（如上所述）(42).然后使用Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter，Brea，CA）对具有红色和绿色荧光的细胞进行分类。将分选后的细胞培养3～5d，筛选出单细胞传代的克隆。指导RNA合成的三个靶序列刺设计（表S2）。胚胎期13.5（E13.5）MEFs来源于装饰件13^+/+或装饰件13^?/?小鼠如前所述制备(67).

抗体、试剂和病毒

表S3列出了本研究中使用的抗体和主要试剂。将HSV-1（F株，中国医学科学院李Q.ligift）和VACV（ATCC，Manassas，VA）在Vero细胞单层中增殖。对于体外感染，细胞分别感染HSV-1[感染多重性（MOI）=5]或VACV（MOI=5）。Poly（dA:dT）（5μg/ml）和3′，3′-cGAMP（5μg/ml）均来自加利福尼亚州圣迭戈市InvivoGen。其他非特定试剂从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）购买。

质粒、转染和RNA干扰

如所述，构建了编码小鼠TRIM13（GenBank，no.NM_001164220.1）和STING（GenBank，no.NM_028261.1）以及指示突变的重组载体(42,65,66)。用于RAW264中质粒的瞬时转染。7和HEK293T细胞，根据制造商的说明使用X-tremeGENE HP试剂（英国威尔温花园城罗氏）。暂时击落装饰件13三个字母的人或老鼠装饰件13根据标准方案（Polyplus转染公司，Illkirch，France）合成并使用干扰素HTS转染。特异性siRNA双工体刺（sc-154411）和第62页（sc-35233）从圣克鲁斯生物技术公司（德克萨斯州达拉斯）获得。特异性siRNA序列Rnf5型,装饰件29，和Trim30a型如表S2所示。无义序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACG-3′作为对照siRNA。

定量聚合酶链反应

用TRIzol试剂（Invitrogen Corporation，CA，USA）提取细胞总RNA，用AMV（禽成髓细胞增生病毒）逆转录酶试剂盒（Promega，Madison，WI）合成cDNA。mRNA定量方法如下所述(42,65,66)底漆顺序见表S2。

细胞因子的酶联免疫吸附测定

小鼠IFNβ、TNF和IL-6的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒来自明尼苏达州明尼阿波利斯市的研发系统。培养上清液或血清中细胞因子的浓度按照制造商的建议进行测定。

串联质谱法

如前所述，对TRIM13相关蛋白进行鉴定(42,65,66)纳米超高性能LC电喷雾串联质谱是由北京基因组研究所（中国北京）完成的。

荧光素酶测定

NF-κB和国际单项体育联合会荧光素酶报告质粒从Affymetrix（加利福尼亚州圣克拉拉）的Panomics获得。荧光素酶活性测定采用双荧光素酶报告系统（普罗梅加，麦迪逊，威斯康星州）。报告者交易激励的测定如前所述(42,66).

IP和免疫印迹

使用抗TRIM13、抗刺、抗Flag或抗Myc抗体的IP和免疫印迹分析如前所述进行(42,66)用ImageJ软件对蛋白质条带进行定量分析。

免疫荧光共聚焦显微镜

RAW264。将7个细胞、MEFs或HeLa细胞与TRIM13-RFP或STING-GFP载体瞬时共转染48小时。样品在PBS中短暂洗涤，并在4%多聚甲醛中固定。对于使用细胞器标记物的TRIM13或STING的共定位分析，细胞在含有0.5%皂甙的封闭缓冲液中渗透，然后依次用抗KDEL、EEA1、TOM20或高尔基58K和俄勒冈州绿488-结合二级抗体染色。共聚焦显微镜下，细胞立即用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）（10μg/ml）染色并用盖玻片覆盖。图像由激光扫描共焦显微镜（徕卡TCS SP8）获得，并用lasx软件版本2.0.2.15022进行分析。

多泛素分析

为了检测STING的多泛素化，细胞在添加了1%Triton X-100、1%NP-40和300 mM NaCl的严格溶解缓冲液中裂解。用1%十二烷基硫酸钠（SDS）加热变性，然后用抗螫抗体和蛋白A/G微球进行IP变性。用裂解缓冲液广泛洗涤小球四次。最后，在SDS样品缓冲液中溶解，westernblot检测STING的泛素化(42,66).

ER隔离

根据推荐和描述，使用内质网分离试剂盒（#ER0100，Sigma-Aldrich）纯化ER组分(68).BMDMs、MEFs或RAW264。从5个15厘米的培养皿中收集7个细胞，通过22号针使其均匀化，直到～85%溶解。匀浆在1000下按顺序离心g10分钟，12000g15分钟10万g一个小时。将微丸（粗微粒体）重新悬浮在1×等张萃取缓冲液中【10 mM Hepes（pH 7.8）、250 mM蔗糖、25 mM氯化钾和1 mM EGTA】，并将其装载到15%至23%的OptiPrep梯度上，并在80000下超速离心18小时g免疫印迹法用于鉴定ER最富集的部分。质量控制：以calnexin为阳性对照，TOM20、EEA1和golgi58k为阴性对照。

动物模型和操作

用具有指定基因型的年龄和性别匹配的小鼠建立动物模型。体内致病菌感染小鼠腹腔注射100μl含2×10的PBS⁸或5×10⁸HSV-1的PFUs。为了模拟HSV-1的神经感染，100μl的PBS含有2×10⁸尾静脉注射HSV-1的PFUs。用qPCR法测定肝、脾、肺、脑的微生物滴度Icp0型HSV-1的mRNA或如前所述通过斑块形成分析(42,65).

为了检查器官的炎症，用戊巴比妥（50mg/kg）腹腔麻醉小鼠，从眼球中提取血液，通过颈椎脱位安乐死，并用15ml无菌PBS经右心室冲洗。切除肝、肺、肾、脑、心，用4%福尔马林固定，石蜡包埋，切4-μm切片，贴于玻片上，脱蜡，如前所述，免疫荧光显微镜观察病灶内的免疫细胞亚群(66)，荧光抗体见表S3。为了治疗自身炎症，10个月大的婴儿装饰件13^?/?小鼠腹腔注射玉米油176～300μg/d。

为了探讨TRIM13与自身免疫症状之间的潜在联系，我们采用小鼠IgM（ab133047）和Abcam（马萨诸塞州剑桥）的IgG（ab151276）ELISA试剂盒测定血清IgG和IgM水平。用抗体在线有限公司（德国亚琛）的ELISA试剂盒检测血清中抗ANA（ABIN772680）和dsDNA（ABIN627743）的自身抗体。

对于dsDNA免疫实验，在第1天用基因组DNA（每只小鼠50毫克；从10μM地塞米松治疗48小时后凋亡的胸腺细胞中获得）和弗氏完全佐剂（Sigma-Aldrich）对8周龄的指定基因型小鼠进行皮下免疫，然后在第14天和第28天皮下注射凋亡胸腺细胞DNA（50毫克/只小鼠），用不完全弗氏佐剂（Sigma-Aldrich）乳化，共注射两次。7天后采集血清标本进行抗dsDNA抗体ELISA检测。

统计分析

所有的实验都独立地重复了至少两到三次。结果以means±SE或means±SD表示。样本大小是通过标准方法选择的，以确保足够的功率和不排除。两组之间的比较是用两个未配对的学生的t测试。采用单因素方差分析（ANOVA）进行多重比较，然后进行Bonferroni多重比较。采用Kaplan和Meier法监测小鼠存活情况，并用log-rank检验进行分析。统计显著性确定为Ptrans data-src=" 0.05. "<0.05。所有的统计数据都是用GraphPad Prism 7.0软件进行的。