George Church团队发表封面文章：安全地将治疗基因植入人类基因组

哈佛大学威斯生物启发工程研究所、哈佛医学院和瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员开发了一种计算方法，以确定GSHs位点，该位点具有显著更高的安全插入治疗性基因的潜力，并在许多细胞类型中持久表达。

　　

   

   

哈佛大学维斯研究所和瑞士苏黎世联邦理工学院的一个合作研究小组在人类基因组序列的混乱中确定了基因组安全港(GSHs)，可以将治疗基因植入其中。作为验证的一部分，他们将荧光GFP报告基因插入候选GSHs中，并随时间跟踪其表达。这幅插图为团队赢得了《 Cell Reports Methods 》杂志的封面。

通过所谓的“基因组安全港”(GSHs)，许多未来用于治疗癌症、罕见基因和其他疾病的基因和细胞疗法可能在疗效、持久性和可预测性方面得到增强。这些是人类基因组中的着落点，能够安全地容纳新的治疗基因，而不会对细胞基因组造成其他意想不到的变化，从而对患者构成风险。

 

然而，寻找具有临床转化潜力的GSHs就像为航天器寻找月球着陆点一样困难——月球着陆点必须在平滑和可接近的区域，不太陡峭，周围是大的山丘或悬崖，提供良好的能见度，并能够安全返回。同样，GSH也需要通过基因组编辑技术获得，避免基因和其他功能序列等物理障碍，并允许“落地”治疗基因的高、稳定和安全表达。

 

到目前为止，只有少数几个候选的GSHs被探索过，而且它们都带有某些警告。要么它们位于基因相对密集的基因组区域，这意味着它们中的一个或几个可能会被插入其附近的治疗性基因破坏功能，要么它们包含可能在无意中被激活的与癌症发展有关的基因。此外，候选的GSHs还没有被分析是否存在调控元件，尽管它们本身不是基因，但可以从远处调节基因的表达，也没有分析插入的基因是否会改变整个基因组中细胞的整体基因表达模式。

 

现在，哈佛大学威斯生物启发工程研究所、哈佛医学院(HMS)和瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员合作，已经开发了一种计算方法，以确定具有显著更高的安全插入治疗基因和在许多细胞类型中持久表达的GSH位点。在2000个预测的GSHs位点中，该团队对过继T细胞疗法和针对皮肤病的体内基因疗法进行了深入验证。通过工程鉴定的GSHs位点，分别在T细胞中携带报告基因，在皮肤细胞中携带治疗基因，他们证明了新引入的基因的安全和持久的表达。这项研究发表在《 Cell Reports Methods》杂志上。

 

“虽然GSHs可作为基因靶向的通用平台，从而加快基因和细胞疗法的临床发展，但到目前为止，人类基因组的任何位置都没有得到充分验证，所有这些都只能用于研究应用。”该研究的资深作者、维斯核心教员George Church博士说。“这使得我们朝着高度验证的GSHs采取的合作方式向前迈出了重要的一步。再加上我们在实验室开发的更有效的靶向基因整合工具，这些GSHs可以为未来的各种临床转化工作提供支持。”Church是Wyss研究所合成生物学平台的领导者，也是HMS的Robert Winthrop遗传学教授，哈佛大学和麻省理工学院的健康科学和技术教授。

 

研究人员首先建立了一个计算管道，通过利用人类细胞系和组织的大量可用测序数据，来预测基因组中有潜力用作GSHs的区域。“在这一步一步的全基因组扫描中，我们通过计算排除了编码蛋白质的区域，包括参与肿瘤形成的蛋白质，以及编码在基因表达和其他细胞过程中具有功能的特定类型的RNA的区域。我们还消除了包含所谓的增强子元素的区域，增强子元素通常在远处激活基因的表达，以及组成染色体中心和末端的区域，以避免细胞分裂时染色体复制和分离的错误。”第一作者Erik Aznauryan博士说，“这给我们留下了大约2000个候选基因座，用于临床和生物技术目的的进一步研究。”

 

作为研究生，Aznauryan和Sai Reddy在苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系实验室的其他成员一起开始了这个项目，之后他参观了Church实验室作为他研究生工作的一部分，在那里他与Wyss技术开发研究员Denitsa Milanova合作，此后，他作为博士后研究员加入了Church的团队。Reddy是这项合作研究的高级和主要作者，是苏黎世联邦理工学院的系统和合成免疫学副教授，专注于开发系统和合成生物学的新方法，以工程免疫细胞的多样化研究和临床应用。

 

研究组在2000个被确认的GSHs位点中，随机选择5个，在人类普通细胞株中，利用快速、高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术，将报告基因插入其中。其中两个GSHs位点允许插入的报告基因特别高的表达——事实上，显著高于将同一报告基因工程到两个较早一代GSHs的团队实现的表达水平。重要的是，两个GSHs位点所携带的报告基因并没有上调任何与癌症相关的基因。Aznauryan说，这是因为，在染色体的线性DNA序列中，距离较远的区域，但在折叠染色体的不同区域相互接触的三维基因组中，如果再插入一个基因，就有可能共同受到影响。

着眼于临床

 

为了评估人类细胞类型中对细胞和基因治疗有兴趣的两个最引人注目的GSHs位点，该团队分别在免疫T细胞和皮肤细胞中进行了研究。T细胞被用于许多癌症和自身免疫性疾病的过继细胞治疗中，如果将受体编码的基因稳定地插入到GSH中，可能会更安全。此外，控制不同皮肤层细胞功能的基因发生有害突变而引起的皮肤病，有可能通过将突变基因的健康拷贝插入并长期表达为补充这些皮肤层的皮肤细胞的GSHs来治愈。

我们将荧光报告基因引入了从血液中获得的人类初级T细胞中的两个新的GSHs，并将一个功能完整的LAMB3基因(皮肤中的细胞外蛋白)引入了人类初级真皮成纤维细胞中的相同的GSHs，并观察到持久的活性。虽然这些GSHs在治疗方面具有独特的地位，可以提高父细胞和子细胞的基因表达水平和持久性，但我对新出现的‘功能获得’细胞增强功能感到特别兴奋，它可以增强细胞和器官的正常功能。安全方面是最重要的。与Wyss的创业团队一起，Milanova正在开发一个专注于皮肤年轻化的基因再生和增强平台。

 

Reddy说:“我们对GSHs工程的原始人类T细胞进行了广泛的测序分析，清楚地表明，这种插入具有最小的导致肿瘤促进作用的可能性，这一直是在为治疗用途而对细胞进行基因改造时的主要担忧。正如我们在这里所做的，多个GSHs位点的识别，也支持了建立更先进的细胞疗法的潜力，使用多种转基因来规划复杂的细胞反应，这在癌症免疫治疗的T细胞工程中尤其相关。”

 

“这项跨学科合作的努力表明，在保持对临床翻译的关注的同时，将计算方法与基因组工程集成的力量。人类基因组中GSHs的发现将极大地促进未来发展疗法的努力，使其专注于更有效、更安全的基因和细胞疗法的工程。”Wyss的创始董事Donald Ingber医学博士说。

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