禁食通过p53依赖的代谢协同作用改善肝细胞癌的治疗反应

禁食通过p53依赖的代谢协同作用改善肝细胞癌的治疗反应

　　

摘要

细胞可以贪婪地利用这些营养物质来治疗癌症。在这里，我们在肝细胞癌（HCC）细胞、异种移植物和患者来源的类器官中发现，禁食提高了索拉非尼的疗效，并协同作用致敏索拉非尼耐药肝癌。从机械上讲，索拉非尼作为线粒体呼吸的抑制剂，使耐药细胞依赖糖酵解存活。禁食，通过降低葡萄糖和阻碍AKT/mTOR信号传导，阻止了这种沃堡转移。p53调节葡萄糖转运蛋白和促凋亡蛋白的表达，是空腹索拉非尼致敏作用的必要和充分条件。p53在原位肝细胞癌小鼠模型中对禁食介导的索拉非尼疗效的改善也是至关重要的。总之，我们的数据表明禁食和索拉非尼是治疗p53信号完整的肝癌的合理联合疗法。由于肝细胞癌的治疗目前受到耐药性的严重限制，这些结果将有助于临床研究，旨在改善晚期肝癌的治疗效果。

简介

许多晚期实体瘤病例对靶向治疗仅表现出暂时的反应，因为对最初有效的标准治疗药物产生了耐药性。随之而来的残余疾病(1)对无进展患者生存构成严重障碍。适应性(2)以及癌细胞的代谢灵活性(三)是抵抗肿瘤靶向治疗的关键机制。联合疗法是一种很有前途的策略，因为它们针对多种途径，为癌细胞在其他促进生长的分子途径上繁衍生息留下了较少的回旋余地。

饮食干预，特别是营养限制疗法，如禁食或生酮饮食，具有支持传统癌症治疗的巨大潜力(4,5)。虽然不同研究的营养限制方案有很大差异（限时喂食、每隔一天禁食、连续几天禁食或限制某些营养素或卡路里的饮食）(5)，共同点是代谢物（主要是葡萄糖、酮体和氨基酸）、激素（如胰岛素、胰高血糖素和糖皮质激素）和生长因子（最显著的胰岛素样生长因子1）的系统变化(6)在癌症治疗中使用禁食的基本原理是基于癌细胞的特定和一般特征：它们不服从抗生长信号(7)有明显的合成代谢欲望(8,9)因此，癌细胞无法适当适应禁食条件(10)大量的临床前研究支持这一推理，表明当不同的禁食方案与标准的护理药物相结合时，肿瘤发生率降低，治疗抵抗力降低，或不良反应减少(10–12)。一些临床试验正在进行中[在(13)]并将很快提供关于动物模型数据的适用性和可翻译性的数据。然而，请注意，禁食的反应是特定于癌症类型及其突变情况的(5)因此，有针对性的研究需要验证禁食/药物组合，将癌症类型、患者和肿瘤内异质性因素考虑在内，以实现最近提出的分层方法(4).

肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌(14)它是全球最致命的癌症之一，发病率不断上升(15)这是由于早期疾病对经典化疗药物（如阿霉素和顺铂）和靶向药物缺乏反应所致(16)对于晚期肝癌，索拉非尼一直是一线治疗的主流(17)在其他更昂贵的药物不可用或在阿替唑单抗/贝伐单抗治疗后进展的情况下仍经常使用(18,19)索拉非尼已被证明是内皮细胞室（抗血管生成途径，如血管内皮生长因子抑制）和肝细胞的多激酶抑制剂[主要作为快速加速纤维肉瘤（RAF）抑制剂](20)在一项具有里程碑意义的安慰剂对照临床试验中，索拉非尼被证明可以提高3个月的总生存率，而没有出现完全缓解的情况(21)这种温和的治疗成功很大程度上归因于索拉非尼耐药性的发展(20)虽然已经提出了几种耐药机制，但许多报道集中在索拉非尼治疗后磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/mTOR和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号的过度激活[(20)].因此，需要一种新的联合治疗方法来改善肝癌患者的临床状况。

在这里，我们展示了体内外的证据，营养限制可以使索拉非尼耐药肝癌模型敏感，并提高索拉非尼反应模型的疗效。我们明确了索拉非尼协同作用的致敏机制，索拉非尼是线粒体呼吸的有效抑制剂，而饥饿或禁食则通过限制葡萄糖的可用性来阻止沃堡转移。我们进一步证明p53通过协调葡萄糖摄取和促凋亡蛋白的表达来实现这种致敏作用。综上所述，我们的数据表明，禁食作为索拉非尼在p53阳性肝癌中的有效佐剂，应该会启发临床研究来仔细研究这种合理的综合治疗方法。

结果

营养限制协同致敏耐药肝癌细胞、异种移植物和患者源性肝癌类器官对索拉非尼的敏感性

内源性和获得性索拉非尼耐药是晚期肝癌无进展生存的主要障碍(20)需要新的联合疗法来克服耐药性。为了研究饥饿是否能减轻索拉非尼的耐药性，我们检测了肝癌来源的HepG2细胞对索拉非尼的反应性。确认以前的研究(22)，HepG2细胞在超临床剂量下对索拉非尼基本保持耐药（图S1A）。HCC患者口服索拉非尼后，血浆索拉非尼浓度在5至20μM之间(23,24)接下来，我们将这些细胞皮下注射到NMRI裸鼠体内，并将其随机分为4组，分别接受载剂对照组或索拉非尼组，再分为随意饮食组、定期禁食组（禁食组）或禁食模拟饮食组（FMD组）(图1A) (25)禁食组每周两次禁食24小时，中间2天或3天随意再进食。虽然这一方案有力地诱导了空腹介导的血浆代谢物的变化（图S1B），小鼠能够完全恢复在再喂养日的体重减轻(图1B).不太温和的禁食方案，例如每隔一天禁食会导致渐进性的体重减轻（图S1、D和F），使得这种方案不适合长期的治疗方案。在重新喂食阶段开始时，口服索拉非尼或溶媒对照品，浓度为30 mg/kg（毒性在单独的实验中评估；图S1，G至I）(21)索拉非尼治疗和单独禁食均不影响肿瘤生长(图1，C和D)然而，超过4周的联合治疗显著抑制了体内肿瘤的生长(图1，C和D)组织学分析显示增殖标记物Ki67的染色无差异（图S1J），而与单独使用索拉非尼相比，联合治疗组观察到坏死细胞斑块更大的趋势（图S1K）。类似于定期禁食，用FMD和索拉非尼（60 mg/kg）进行异种移植实验(图1A)在治疗期间也能保持体重(图1E)口蹄疫与索拉非尼（60mg/kg）联用具有显著的加性效应(图1，F和G)而单次治疗仅显示最终肿瘤大小减小的趋势(图1G)这些结果表明，定期禁食或口蹄疫可分别以协同或加性的方式缓解索拉非尼耐药性。

为了从机理上研究这种协同作用，我们试图在体外模拟营养限制。为此，我们用汉克斯平衡盐溶液（HBSS）为基础的饥饿培养基（SM）诱导培养的肝细胞自噬(26)激活HepG2细胞的空腹反应性AMPK通路(27).当耐药HepG2细胞（图S1A）在SM中保存24小时后，我们观察到索拉非尼剂量依赖性地降低了存活率，而仅仅饥饿并不能降低存活率(图1、H和I)当在治疗48小时后测定生存能力时，这些影响被夸大了（图S1、L和M）。此外，细胞毒性(图1J)以及细胞凋亡(图1K图S1N）在饥饿细胞中以索拉非尼剂量反应方式增加，但在全生长培养基（GM）中没有增加。为了深入了解这种协同效应的动力学，我们使用实时凋亡/坏死分析连续监测细胞。如右图所示图1L在联合治疗开始后4小时，凋亡信号已经升高，而在观察到的时间范围内没有出现坏死。

为了在患者来源的材料中证实这些结果，我们使用了先前描述的抗索拉非尼的类肝癌有机物(28)将这些肿瘤细胞维持在模拟饥饿的培养基中，本身并不会影响它们的生存能力(图1，M和N)。但是，与完全膨胀介质相比(29)，模拟饥饿培养基诱导索拉非尼的存活率呈剂量依赖性下降(图1N)，类似于HepG2细胞的结果（例如。，图1I).

与转化和耐药HCC模型的致敏性相反，在不同暴露方案下，小鼠原代肝细胞的活力基本上不受索拉非尼的影响（图S1，O和P）。这表明索拉非尼选择性靶向HCC细胞，同时使非转化肝细胞不受损伤，这在我们的初步实验中得到了反映（图S1，G到I）。此外，我们的数据与最近的一项研究一致，该研究显示索拉非尼的剂量与我们研究中使用的剂量相似，对肝脏病理学有益处(30)总之，这些结果表明，营养限制与索拉非尼协同作用，通过激活培养细胞、类肝细胞癌和异种移植物中的细胞死亡程序来减轻治疗耐药性。

索拉非尼/饥饿协同作用具有特异性，但不通过典型激酶抑制或单个饥饿反应途径发挥作用

为了验证饥饿和索拉非尼之间的协同作用是否是一种特殊的现象，我们接下来研究了饥饿和阿霉素的联合治疗，阿霉素是一种最近在肝癌试验中与索拉非尼联合使用的化疗药物(31)有效剂量的阿霉素（如图S2A中对阿霉素诱导的DNA损伤的p53稳定化所示）导致饥饿条件下细胞活力的边际降低(图2A).与先前的临床研究一致，表明阿霉素对索拉非尼治疗或索拉非尼治疗失败后没有任何益处(32)，我们没有观察到索拉非尼/阿霉素联合治疗的任何额外效果，无论细胞保持在完全的GM或SM中(图2B)因此，这些数据表明，当饥饿与索拉非尼联合使用时，药物致敏作用是可以实现的，而与化疗药物阿霉素联合使用时，药物致敏作用则不能实现。

在转化肝细胞中，索拉非尼最初被鉴定为靶向RAF激酶，以抑制RAS-RAF-MEK-ERK通路(33)索拉非尼没有抑制这一途径，反而导致细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化的增加(图2C)在耐药的HepG2细胞中，这让人想起以前的报道，索拉非尼和其他BRAF抑制剂激活了这一途径(34,35)为了检测索拉非尼是否通过抑制其他生长途径发挥作用，我们研究了空腹反应性PI3K-AKT-mTOR通路(10,36)在许多癌症中，过度激活是恶性重编程的共同特征(37)通过丝氨酸473的磷酸化来探讨AKT的激活，我们发现索拉非尼处理导致AKT的动态激活(图2C)这可能代表了在其他癌症模型中报道的促进糖酵解的代偿反应(9)以及我们体内对索拉非尼耐药的潜在机制。然而，在仅含低葡萄糖（5.5 mM，而非全GM中为25 mM）且不含生长因子的SM中，AKT活性完全丧失(图2C)，与对索拉非尼的敏感性一致。mTORC1在正常GM中也在索拉非尼处理下被激活，但在饥饿状态下完全钝化，表现为mTORC1底物S6K1和4EBP-1的磷酸化丧失(图2C)通过分析异种移植试验中的肿瘤，可以大致概括联合治疗对生长途径的影响(图2，D和E).

MAPK激酶（MEK）、ERK、PI3K、AKT和mTORC1的靶向药理抑制（图S2，B至F）以及自噬（mTORC1下游）(37)，既没有重述索拉非尼在饥饿状态下的作用，也没有显示饥饿/索拉非尼联合处理对细胞活力的任何额外影响(图2F)这组实验排除了这些途径是饥饿介导的索拉非尼致敏的唯一介质。

因此，在我们的模型中，对索拉非尼治疗的几种生长途径的反常上调可能构成了一种耐药机制(20)克服这种耐药性似乎不依赖于单一的生长途径，而是依赖于饥饿对PI3K-AKT-mTORC1轴的多效性影响，再加上非常规的索拉非尼作用，导致肝癌细胞死亡。

索拉非尼诱导的Warburg偏移在饥饿条件下受葡萄糖限制而减少

以前的一些研究已经描述了索拉非尼对线粒体生物能学的影响(30,38,39)此外，AKT激活可促进线粒体缺陷癌细胞的有氧糖酵解(40)因此，我们研究了这种沃堡位移是否是细胞转化的标志(9)，可能是我们模型中抵抗的潜在机制。

我们首先评估了耐索拉非尼的HepG2细胞在治疗6小时后的氧消耗率（OCR），反映线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），此时细胞活力在所有条件下都不降低（图S3A），AKT被最大程度激活(图2C)。如所示图3（A和B）饥饿导致抑制，索拉非尼治疗严重降低基底和刺激的OCR。显示了一个强大的加成效应，联合治疗完全消除了任何细胞呼吸在治疗后6小时内。基础OCR、三磷酸腺苷（ATP）连接的OCR和最大呼吸量通过单独治疗显著降低，并且在联合治疗后基本上无法检测到(图3B)索拉非尼预处理后再喂入细胞2小时，或饥饿或两者都显示饥饿介导的OCR衰减是完全可逆的，而索拉非尼处理引起细胞呼吸的长期抑制(图3C)，表明恶磷的持续抑制作用。接下来，我们测定了线粒体膜电位。饥饿本身并不影响线粒体膜电位（图S3B）。然而，索拉非尼治疗2小时和6小时显著降低线粒体膜电位(图3D)同时保持线粒体形态完整(图3E)氧代苯对线粒体的影响最为显著(图3，A和B)，我们推断这些细胞可能会执行沃堡向有氧糖酵解的转变，以维持生存。因此，我们实时监测糖酵解功能的急性治疗索拉非尼或寡霉素，一种ATP合成酶抑制剂。索拉非尼在刺激细胞外酸化率（ECAR）方面与寡霉素一样有效，ECAR是糖酵解活性的一个指标(图3F)完全转基因的索拉非尼治疗6小时后，非葡萄糖底物（葡萄糖注射前测量）和添加葡萄糖和寡霉素后ECAR水平增加，这与Warburg偏移一致(图3G，左）。然而，SM预处理的细胞在索拉非尼处理后没有表现出代谢弹性(图3G，右），尽管急性添加葡萄糖可以恢复糖酵解至最大糖酵解能力(图3G，对）。这些数据使我们假设，虽然索拉非尼诱导持续的OXPHOS抑制，导致Warburg向糖酵解的转变，但饥饿可以极大地抑制这种转变，从而降低癌细胞存活率。这意味着饥饿利用索拉非尼作为恶磷抑制剂打开的代谢机会之窗。值得注意的是，与标准GM（25 mM）相比，SM含有低水平的葡萄糖（5.5 mM）。因此，经过6小时的治疗后，该葡萄糖水平可能仍然足以使饥饿和索拉非尼治疗的细胞保持存活（图S3A），方法是增加糖酵解率（如图3所示，在图3B).

为了确定引起饥饿致敏作用的主要代谢物，我们使用了杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM），不含葡萄糖、丙酮酸盐、谷氨酰胺和胎牛血清（FCS）（DMEM）^?/?/?)并观察了这些组分单独加入后的存活率。从上面的数据证实，添加葡萄糖可以立即恢复糖酵解功能(图3G)，只有葡萄糖回补维持细胞活力，而补充谷氨酰胺或丙酮酸都不能挽救细胞活力(图3H).FCS富含生长因子、激素和代谢物，在添加DMEM后，对提高生存能力的作用微乎其微^?/?/?(图3H)本实验表明葡萄糖可能是引起索拉非尼致敏效应的主要代谢产物。为了证实这一点，一个滴定加回实验表明，随着葡萄糖剂量的增加，索拉非尼处理后的细胞活力逐渐恢复(图3I)为了比较这些体外葡萄糖浓度和体内情况，我们测量了血糖(图3J)肿瘤间质液葡萄糖水平(图3K)在喂食和禁食的小鼠中进行异种移植实验。空腹时血浆和间质液中的葡萄糖水平均显著降低至~3mm，这一浓度在体外滴定中不会对细胞活性造成挽救(图3I)另一方面，在加入5 mM葡萄糖后（水平相当于血浆和间质液体喂养的葡萄糖水平），约50%的细胞可以存活，这表明我们的体外实验反映了肿瘤微环境中的葡萄糖水平，以及相应的影响，反之亦然。为了评估葡萄糖对索拉非尼直接治疗下存活率的影响，我们用索拉非尼处理完全转基因的细胞，并增加糖酵解抑制剂2-脱氧的浓度-d-葡萄糖（2-DG）。从化学计量比为1:4（葡萄糖：2-DG）开始，24小时后细胞活力显著降低(图3L)，建立葡萄糖作为索拉非尼饥饿致敏所需的限制性代谢物。这被证实是对索拉非尼耐药的类肝癌(图1，M和N)在完全培养基中，2-DG对糖酵解的抑制显著降低了它们的存活率(图3M).

总之，我们的数据表明，索拉非尼作为一种氧磷抑制剂在HepG2细胞中作为一种氧磷抑制剂，启动华宝向有氧糖酵解的转变。饥饿或禁食通过限制葡萄糖减少了这种新陈代谢的灵活性，同时也使人们对索拉非尼的抗癌作用产生了敏感性。

p53的协同抗肿瘤作用是必需的

肿瘤抑制因子和转录因子p53的功能丧失导致或参与了50%以上的人类癌症的发生(41)约30%的肝癌患者存在p53基因突变。除了其抑癌功能外，p53作为肿瘤代谢的调节因子越来越受到重视(42)，我们最近发表了TP53型蛋白质在饥饿的HepG2细胞中稳定，导致下游靶基因的激活(27).

为了研究p53对索拉非尼致敏的影响，我们用CRISPR-Cas9进行了推导TP53型来自耐药HepG2细胞的敲除（p53KO）克隆（图S4，A和B）。等基因p53KO细胞用同样的饥饿/sorafenib方案处理，用于其p53基因丰富的对应细胞(图1I)生存能力没有明显下降(图4A)或者细胞毒性的增加(图4B)这使得p53缺陷细胞即使在饥饿条件下也能抵抗索拉非尼。为了排除潜在的克隆效应，我们在其他CRISPR-Cas9克隆中验证了这一观察结果（图S4C）并重新表达TP53型在p53KO细胞中（图S4D）。p53的再表达恢复了目标基因的表达（图S4E）和饥饿状态下对索拉非尼的敏感性(图4C，右），表明p53对这种协同作用是必要的和充分的。

接下来，我们在裸鼠体内移植p53KO细胞，然后对它们进行同样的周期性禁食/索拉非尼方案（如图所示）图4D图S4F）对于p53基因丰富的HepG2细胞[p53野生型（p53WT）](图1A)免疫组织化学(图4E)，免疫印迹(图4F)定量聚合酶链反应（qPCR；图S4G）评估p53和p53靶基因表达，证实在体内肿瘤生长试验中持续存在KO。四组皮下肿瘤生长率相似(图4，G和H)在体内证实了禁食/饥饿和索拉非尼协同作用需要p53。

p53通过调节糖酵解速率和糖酵解能力发挥饥饿/索拉非尼协同作用

为了解释p53状态在索拉非尼与饥饿协同作用中的机制，我们首先研究了生长路径和癌细胞代谢。P53重量(图2C)p53KO细胞在接受索拉非尼治疗后，其ERK、AKT和mTORC1通路的激活与SM中AKT和mTORC1信号通路相似(图5A)联合处理完全阻断了p53KO中的OXPHOS，就像p53WT细胞一样（图S5A），而p53KO细胞的糖酵解速率和容量较低(图5、B和C)与p53WT细胞相比。p53WT细胞在对照组和联合治疗组的葡萄糖摄取量保持在相似的水平，而p53KO细胞在联合治疗后显著降低葡萄糖摄取量(图5，D和E)与葡萄糖摄取减少相对应的是肝细胞中最丰富的葡萄糖转运蛋白(SLC2A2型)p53基因缺陷细胞表达强烈下调(图5F)此外，葡萄糖转运蛋白下调(SLC2A1型,SLC2A2型，和SLC2A3系列)联合治疗4周后，p53KO异种移植物也有观察(图5G)葡萄糖的完全耗尽严重影响了p53KO细胞在索拉非尼治疗下的存活率，仅添加葡萄糖而不添加丙酮酸、谷氨酰胺或FCS（图S5B）就足以恢复p53KO细胞的索拉非尼耐药性(图5H以及图S5B）。因此，2-DG阻断糖酵解及索拉非尼治疗可导致p53KO细胞死亡(图5I)与对照组相比，p5o和葡萄糖转运蛋白联合治疗降低了细胞对p5o的摄取能力。虽然p53KO细胞和p53WT细胞一样依赖葡萄糖，但它们“经济地”使用SM中的少量葡萄糖可以延长其存活时间。

p53在联合治疗中协调促凋亡蛋白质组

为了进一步剖析p53对禁食/饥饿和索拉非尼协同作用的必要性，我们对分别用索拉非尼和饥饿或索拉非尼和禁食处理的细胞和异种移植物的p53WT和p53KO样本进行了蛋白质组学比较。总的来说，在p53WT和p53KO细胞以及伴随p53WT和p53KO异种移植物的所有三联实验中，5064种蛋白质被重复检测和定量。其中2770个蛋白质发生了显著变化，采用方差分析（ANOVA）检验[错误发现率（FDR），0.05]。分层聚类正确地将复制品分配给实验组，并识别出四个明显不同的表达谱簇(图6A)簇1和簇4主要由在细胞和异种移植物中表达水平不同的蛋白质组成，而簇2和簇3显示的蛋白表达谱受p53KO的影响类似(图6A)p53的活性仅限于转录激活(43)在p53KO样本中，我们聚焦于含有147个蛋白下调的簇3(图6B)为了进一步区分p53-KO的直接和间接作用，我们将这147个蛋白质与先前meta分析得到的高置信p53靶点重叠(44)通过这种方法，在我们的蛋白质组数据集中，只有8个p53靶点在体内和体外通过p53KO持续下调(图6，C和D)。与联合治疗后细胞凋亡增加一致(图1，K和L)促凋亡调节因子BAX是8个候选因子之一(图6D)在蛋白质和mRNA水平上证实了这一点(图6、E和F)以及异种移植(图6，G和H).BBC3或PUMA），被描述为受p53调控(41)但在蛋白质组学分析中未检测到，p53KO组表达下调(图6，E至H)这些数据表明，p53对肝癌细胞凋亡起着重要作用，联合治疗后更易发生固有细胞死亡。

定期禁食改善无抵抗细胞和原位肝癌小鼠模型中索拉非尼的作用

为了研究索拉非尼/饥饿协同作用在缓解晚期肝癌的耐药性之外，我们使用了索拉非尼敏感性肝癌衍生细胞系Huh6克隆5、HuH-7和JHH-5(图7，A至C)然而，同时饥饿显著提高了索拉非尼在所有三种细胞系中的疗效，这意味着对无抵抗力的肝癌细胞具有协同抗癌作用。

为了测试这种索拉非尼增强饥饿效应是否能在原位肝癌小鼠模型中重现，我们用单剂量二乙基亚硝胺（DEN）治疗小鼠，这是一种在数月内诱导肝细胞癌结节的成熟方案(45).所用小鼠为肝脏特异性条件KO转基因小鼠Trp53[阿尔布克雷尔^T2型X p53基因^{液氧/液氧}老鼠(46);图S6，A至D]。在该模型中，成功地建立了p53KO(图7D)在肝结节形成后（超声显像；图S6E）和开始治疗方案之前，口服他莫昔芬（100 mg/kg）(图7E)这个实验时间线对于将p53状态对治疗效果的影响与p53缺乏对肿瘤发生的长期影响分开是很重要的，正如在生殖系p53KO模型中所预期的那样(47).治疗4周后（随意喂食+索拉非尼或禁食+索拉非尼），再喂养阶段后测量总体重(图7F)没有改变。除了肝末重量(图7G)，我们发现，与fed/sorafenib组相比，在p53基因丰富的HCC中，禁食/索拉非尼组的结节重量减轻(图7H整个肝脏，顶部和底部）。然而，在p53KO组，这种禁食介导的减少是不存在的，这表明p53对于索拉非尼增强周期性禁食的效果是必要的(图7H)，让人想起p53KO-HepG2异种移植的情况(图4，G和H)联合治疗也减少了DEN治疗小鼠p53基因丰富的肝脏中的结节数量（图S6F）。与肝细胞癌结节重量的变化相一致，联合用药后p53WT组血浆中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）等肝损伤标志物浓度明显低于p53KO组(图7I)这不能归因于肝硬化的不同程度，这在我们的模型中无法检测到（图S6G）。然而，其他肝脏标志物保持不变（图S6H）。此外，联合治疗组p53KO肝癌结节中葡萄糖转运体1和2的表达与p53肝结节相比降低(图7J)这一结果与p53KO-HepG2细胞葡萄糖摄取减少一致(图5，D和E)p53KO细胞和异种移植物中葡萄糖转运蛋白表达的降低(图5，F和G)此外，禁食/索拉非尼组肝细胞癌结节中葡萄糖和乳酸水平降低，β-羟基丁酸水平显著升高（图S6I），表明禁食影响肿瘤微环境中的代谢物浓度。促凋亡基因Bak1型,巴克斯，和彪马p53KO组和/或联合治疗组表达下调(图7K)总体而言，我们从非耐药肝癌细胞系和原位肝癌小鼠模型中获得的数据表明，饥饿/禁食联合索拉非尼可增强治疗效果，因此需要进一步研究，以确定索拉非尼与禁食方案联合应用是否可用于早期无抵抗肝癌。

讨论

我们的研究提供了证据，营养限制可以减轻人肝癌模型中索拉非尼的耐药性，并且可以提高索拉非尼在非耐药环境中的疗效。我们的数据建立了索拉非尼介导的OXPHOS抑制和通过营养限制限制限制血糖之间的代谢协同作用，对癌细胞代谢造成“双重打击”(图8)这项观察，如果可以推广的话，为肝癌的治疗创造了一系列新的联合治疗机会：葡萄糖限制方案或抗糖药与OXPHOS抑制剂的组合。为了支持这一原理，先前的研究表明通过靶向己糖激酶II抑制糖酵解(48,49)或者乳酸脱氢酶(50)索拉非尼疗效增强，与我们在无抵抗模型中的结果一致(图7)在HuH-7细胞中，索拉非尼和丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂二氯乙酸（DCA）联合治疗(51)或者阿司匹林（通过抑制PFKPFB3抑制糖酵解）逆转获得性索拉非尼耐药性。这种尝试在其他癌症实体中也被证明是成功的。例如，葡萄糖限制和二甲双胍的联合应用（显示为线粒体复合物I抑制剂）(52)导致移植结肠癌或黑色素瘤细胞的小鼠肿瘤生长受限(53)尽管索拉非尼和二甲双胍的主要作用机制明显不同，但由于两者都能作为OXPHOS抑制剂发挥作用，再加上二甲双胍具有良好的临床安全性，这一事实应能促进对二甲双胍/饮食限制组合治疗肝癌的研究。总的来说，这些例子和我们的结果表明，靶向线粒体代谢可以成功地与抑制糖酵解的策略相结合(54)然而，糖酵解的药物靶向性可能会对非转化细胞产生不良影响(54)或者通过使用其他代谢物或营养素来激发癌细胞产生抵抗力(55).禁食对生长途径和各种代谢物[包括但不限于葡萄糖]的多效性和全身性影响(5,6,56)]另一方面，它可以抑制其他的肿瘤发生途径，同时对那些已经进化出适应频繁禁食期的非转化细胞是安全的(5)第一个评估禁食作为癌症治疗辅助手段的临床试验证实了积极的安全性(5,57)肝细胞癌的局限性是肝细胞癌的一种有效的治疗方法(21)然而，我们的研究结果显示在相对较低剂量的索拉非尼的联合治疗中会产生有益的效果。对于患者，在整个治疗期间，每天给予约10毫克/千克体重的剂量。这相当于小鼠每天120毫克/千克(58)，而我们一周只涂抹两次60毫克/千克。此外，我们选择了相当温和的禁食方案，允许在再喂养期间完全恢复体重。由于我们在这些适度的条件下已经看到了显著的协同效应或加性效应，可以认为适度的空腹/降糖可以用来提高低剂量索拉非尼的疗效。这将减少不良反应，并可能使索拉非尼对超过Child-pugha人群的肝硬化HCC患者更为有效。在任何情况下，对恶病质、肌萎缩和肝功能标志物等参数的仔细评估对于将空腹作为辅助治疗的患者分层是很重要的。另一个潜在的翻译限制是联合疗法的毒性。在这方面，我们观察到索拉非尼（30mg/kg）定期禁食和索拉非尼（60mg/kg）合并FMD导致异种移植物生长相似的减少(图1)表明有效药物剂量可以通过相应饮食限制的严格程度和频率进行调整。另一个重要的翻译考虑是应用各自的联合治疗方案的时机。我们选择在禁食或口蹄疫后应用索拉非尼与其他研究结果一致，这些研究报告说，只有在生酮饮食之后或期间应用索拉非尼才能提高药物疗效(59)或者快车(53)这强调了在葡萄糖/糖原耗尽状态下靶向癌症代谢的重要性，并可能与代谢联合疗法的临床意义相关。

图8空腹与索拉非尼之间p53依赖性协同作用的总结方案。

在耐药肝癌模型中，索拉非尼以非特异性方式抑制恶磷，导致糖酵解转变，并在营养丰富的条件下存活。空腹和饥饿状态下的低葡萄糖抑制糖酵解通量，使肝癌细胞对索拉非尼作用敏感。非功能性p53通过降低葡萄糖摄取率（导致在禁食状态下更经济地使用可用葡萄糖）和减少促凋亡蛋白的表达来防止这种敏化，最终提高联合治疗的生存率。此外，禁食/饥饿提高了索拉非尼在无抵抗模型中的疗效。

与我们关于p53的数据一致，最近一项针对黑色素瘤和乳腺癌细胞的研究显示，Rev1-p53轴通过调节联合治疗过程中促凋亡基因的表达，对于饥饿的抗肿瘤作用是必要的(60)我们在HepG2细胞中的数据表明，与固有细胞死亡相似(61)而p53缺失导致促凋亡因子表达减少。尤其是促凋亡效应剂Bax是p53的直接转录靶点(62)，在体外和体内均持续下调，可能使p53KO细胞在我们的饥饿/禁食方案中通过相对较短的饥饿期抵抗凋亡刺激。自从BH3模拟物被证明能使肝癌细胞对索拉非尼敏感(63)这可能是克服p53KO实体恢复抵抗的一种有用的附加疗法。

除了缓解耐药性外，禁食还提高了索拉非尼敏感细胞系（WT（HepG2和Huh6）和突变型（HuH-7和JHH-5）对p53的疗效(64)而JHH-5细胞具有不损害p53和p21蛋白丰度的框内缺失(65)有报道称，HuH-7细胞表达突变的p53蛋白，这种突变蛋白不会转移到细胞核中。然而，它仍然可以通过转录后机制诱导细胞凋亡(66)因此，可以想象，在HuH-7细胞中，突变的p53通过我们在HepG2细胞中的蛋白质组学筛选，通过凋亡启动发挥作用。进一步的研究有助于阐明HCC相关p53突变体的特异性作用。

除了p53介导的细胞凋亡外，我们还发现在p53缺陷和p53精通的小鼠HepG2异种移植物和肝癌结节中的几种葡萄糖转运体表达下调。尽管p53检测显示抑制作用过剩1(SLC2A1型)以及过剩4(SLC2A4系列)发起人(67)，p53可能是调控染色质或细胞内葡萄糖转运蛋白所必需的，这可能涉及一组p53效应器，包括microRNAs。然而，p53对HCC细胞有效Warburg转移的要求与p53作为肿瘤抑制因子的作用是一致的，它不仅协调细胞周期进程和凋亡，而且特别是协调癌细胞代谢(41,42).

综上所述，本文所提供的数据可以为改善晚期肝癌治疗打开新的治疗窗口，并将启发应用禁食/索拉非尼联合治疗的临床试验，即使对于目前尚无有效分子疗法的早期/中期肝癌。此外，我们关于p53的数据具有临床意义，因为这些数据表明，在开始此类联合治疗之前，应将患者的p53状态纳入诊断范围。

材料和方法

细胞培养

HepG2和Huh6克隆5细胞系购自美国型培养物集，并在含有25 mM（4.5 g/L）的DMEM（Gibco，Life Technologies）的GM中培养d-葡萄糖，补充4 mM我-谷氨酰胺（谷氨酰胺，Gibco，生命技术）、10%FCS（GE Healthcare Life Sciences）和青霉素链霉素（500 U/ml；Gibco，Life Technologies），在37°C的增湿空气中，加入5%的CO₂.SM由HBSS和CaCl组成₂和氯化镁₂（Gibco，Life Technologies）含5.5毫米（1克/升）d-葡萄糖，辅以10 mM Hepes（Gibco，Life Technologies）。HuH-7和JHH-5细胞系购自JCRB。HuH-7细胞在含10%FCS和青霉素链霉素（500u/ml）的低葡萄糖（1g/l）DMEM中生长，而JHH-5由S.Nagamori建立(68)]细胞在Williams'E培养基中生长，培养液中含有10%FCS和青霉素链霉素（500u/ml）。

使用了以下细胞培养补充剂：2-DG（圣克鲁斯生物技术公司），d-葡萄糖（Sigma-Aldrich）、丙酮酸钠（Gibco，Life Technologies）、Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS；Gibco，Life Technologies）和DMEMd-葡萄糖，我-谷氨酰胺和丙酮酸钠（Gibco，Life Technologies）。使用了以下疗法：索拉非尼（LC实验室）和阿霉素（辉瑞）。索拉非尼溶于二甲基亚砜（DMSO）中，形成10 mM储备溶液，用于细胞培养。使用了以下抑制剂：SCH772984 ERK1/2抑制剂（Cayman Chemicals）；u0126mek抑制剂（Promega）；wortmannin（HY-10197）、buparlisib（HY-70063）和MK-2206盐酸（HY-10358），均来自MedChemExpress；巴非霉素A1（BioMol）；和雷帕霉素（生命技术，NOVEX）。

原代小鼠肝细胞

用氯胺酮（辉瑞）/甲苯噻嗪（拜耳）（8～1.2%）混合液（4μl/g）麻醉C57BL/6J小鼠。通过泵送（4ml/min，5min）预热灌注缓冲液（EBSS不含CaCl）进行肝脏灌注₂/氯化镁₂0.5毫米EGTA；通过插入腔静脉的导管。然后用预加热消化缓冲液消化肝脏，该缓冲液由HBSS和5000 U胶原酶I（沃辛顿生化）组成。然后，肝脏被切除，在冰上切下GM并通过细胞过滤器。以770rpm离心细胞获得悬浮液3分钟。随后，将颗粒重新悬浮在25 ml GM和25 ml Percoll缓冲液（Biochrom）（含有5 ml 10×PBS和45 ml Percoll）中，以770 rpm离心10 min。丢弃含有死细胞的上清液，并再次将颗粒重新悬浮在25 ml GM中并离心。电池（2×10⁵)接种在I型胶原（康宁）涂层板上。

患者来源的类器官培养

由M.H.（德国德累斯顿Max Planck Institute，Dresden）提供的患者来源于HCC的类器官（sorafenib耐药HCC-1株）(28)。如原始出版物所述(28)，人体标本取自鹿特丹伊拉斯谟医学中心（MEC-2013-143）、剑桥大学医院NHS信托基金（REC:15/LO/0753，经NRES委员会伦敦威斯敏斯特批准）和爱丁堡皇家医院（REC:15/ES/0097）进行的肝肿瘤切除。样品的处理和处理按照HTA指南进行。剑桥的样本由剑桥转化医学生物库提供。所有患者均提供知情同意书。采集样本，并在英国剑桥大学Wellcome Trust/CRUK-Gurdon Institute的机构审查委员会的批准下进行了组织收购(28).

如前所述，类器官被解冻和扩张(29)在实验中，从两个完全致密的50μl基质凝胶液滴（24孔板上的两个孔）中收获类有机物，并在96孔板中的每孔5μl液滴中植入50μl培养基。GM与类有机膨胀介质相同(29)其中，类有机物SM由三部分有机物膨胀介质[含葡萄糖（3.1g/l）]和七份不含葡萄糖的DMEM组成。类有机物SM的最终葡萄糖浓度为0.93克/升，与含有葡萄糖的细胞系（1克/升）使用的SM相似。类有机物在GM或SM中保存6天，有或没有索拉非尼和/或2-DG，每隔2天补充一次培养基和索拉非尼。然后，进行活性测定。

活力测定

活力测定，2×10⁵细胞在96孔板（Thermo Fisher Scientific）中每孔接种200μl GM，以达到完全融合。细胞在37°C和5%CO下附着24小时₂然后，丢弃培养基，用PBS冲洗细胞。接下来，按照结果中的描述对细胞进行处理。根据制造商的说明，使用EZ4U分析法（生物医学免疫分析法）分析细胞活力。简单地说，在处理结束时，用新鲜的GM（每孔200μl）和每孔20μl的EZ4U工作液代替培养基。在37°C下培养2小时后，在492 nm处测量吸光度，参考波长为620 nm（Spark 10M多模微板阅读器）。

龙胆紫染色

丢弃培养基，加入碳醇龙胆紫溶液（Roth）染色。培养15分钟后，用去离子水冲洗细胞几次，直到染料停止脱落。细胞在室温下干燥。

实时凋亡坏死检测

细胞凋亡和坏死分析采用实时Glo膜联蛋白V凋亡和坏死分析（Promega）。HepG2细胞（2×10⁴)每口井培养24小时，每口培养基温度为37℃、培养基温度为96℃₂作为依恋。培养24小时后，去除GM，用PBS冲洗细胞。在按照制造商的说明添加100μl检测试剂之前，向细胞提供100μl无酚红GM或SM。分别于治疗后0、2、4、6、8、24、26h测定荧光和荧光强度。在37°C下使用轨道平均作为扫描模式进行测量，扫描直径为4 mm。在470-480nm的发射波长下测量了发光，获得了3600和5mm的焦距增益。在485±10 nm的激发范围内测量荧光，并在525±20的发射范围内收集荧光，增益为1000，焦距为5 mm（CLARIOstar Plus，BMG Labtech）。

流式细胞术annexin V/7-AAD分析

HepG2细胞（1×10⁶)在24孔板（Thermo Fisher Scientific）中播种并在含有5%CO的增湿空气中培养24小时₂随后，将培养基改为新鲜GM或SM，并用索拉非尼处理细胞24或48小时。然后根据异硫氰酸荧光素膜联蛋白V凋亡检测试剂盒说明书用7-AAD（BioLegend）对细胞进行标记，修改后7-AAD的含量加倍。

乳酸脱氢酶测定

将细胞接种并按活性测定所述进行处理。根据提供的手册使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（Takara），对上清液进行了修改，将上清液稀释10倍，以保持在光度计的可测量范围内（SPARK 10M TECAN）。

免疫印迹

将培养细胞刮取，收集于放免沉淀试验（RIPA）缓冲液中，包括phostop和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）。异种移植和肝细胞癌小鼠标本在RIPA缓冲液中用金属珠和LT组织分析仪（Qiagen）均质化。所有样本均经超声处理（超声探头，10%输出时为3310 s）并离心。清清的上清液用于用双辛酸分析法（Thermo Fisher Scientific）测量蛋白质浓度。每个样品取30μg蛋白质进行Western印迹。使用以下抗体：pERK1/2（4370）、ERK1/2（4695）、pAKT（4060）、AKT（4691）、p4E-BP1（2855）、4E-BP1（9452）、磷酸p70 S6激酶（9206）、p70 S6激酶（9202）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；2118S）、p21（2947S）、Bak（12105）和Bax（5023），均来自细胞信号技术；p53（DO-1，sc-126，圣克鲁斯生物技术公司），长春新碱（PA5-29688，Invitrogen），LC3（NB100-2220，NOVUS），ACTB（ab6276，Abcam）和Puma（sc-374223，圣克鲁斯生物技术公司）。使用Image Studio Lite（LI-COR Biosciences）对信号强度进行密度定量。

用CRISPR-Cas9系统构建稳定的p53-KO细胞系

CRISPR-KO质粒由圣克鲁斯生物技术公司（sc-416469）提供，并按说明书进行实验。HepG2细胞（1×10⁶)在转染前72小时将无抗生素GM接种于6孔板中。用10μl UltraCruz转染剂（sc-395739）转染1.5μg的对照质粒或KO质粒，转染细胞达到60%。阳性克隆的筛选是在含有嘌呤霉素的GM（sc-108071；2μg/ml）中培养10天。细胞分析，红色荧光蛋白阳性（RFP⁺)通过荧光激活细胞分选（FACS；FACSAria IIu，BD Biosciences）分离克隆。然后进行单细胞克隆分离RFP⁺来自单个细胞的群体。用表达CRE重组酶（sc-418923）的质粒再次转染不同的克隆（与第一次转染相同），然后通过FACS再次分析。征求建议书^?通过westernblot和qPCR进行细胞分离和分析，验证p53完全KO。

电穿孔法过度表达p53基因

按照制造商的说明，使用氖转染系统100-μl试剂盒（赛默飞世尔科学公司）进行电穿孔。电池（2×10⁶;HepG2 WT或HepG2 KO细胞）用于每次电穿孔。以2μg pcDNA3 flag p53或2μg HisMax作为载体对照。脉冲条件电压/宽度/脉冲设置为1400/30/1。将转染细胞接种于96孔板中，在标准条件下培养24小时。

RNA分离与qPCR

根据制造商的说明，使用PeqGOLD总RNA试剂盒进行RNA分离。用NanoDrop（ND-1000，分光光度计，peqLab）测定RNA浓度。根据Thermo Fisher Scientifier RevertAid RT试剂盒，使用随机六聚体引物混合物（1μl）将分离的RNA反向转录为cDNA。样品（总体积为12μl）由稀释在无核酸酶水中的模板RNA（1μg、500 ng或200 ng）和引物组成，在65°C下在DNA引擎二元Peltier热循环器（Bio-Rad）中培养5分钟。随后，添加以下试剂：5×反应缓冲液（4μl）、核糖核酸酶抑制剂（20 U/μl，1μl）、10 mM dNTP，这是一种常用术语混合物（2μl）和回复性RT（200 U/μl，1μl）。然后将样品在25℃下在热循环器中培养5 min，随后在42℃下培养60 min，在70℃下培养5 min。将cDNA样品稀释至1 ng/μl并储存在?20°C。在96或384孔板中进行qPCR。因此，在96孔板中，每次反应使用2.5μl cDNA（1 ng/μl）、5μl SYBR Green（Bio-Rad）和2.5μl引物混合物（800 nM，正向和反向），或在384孔板中每次反应使用1.5μl cDNA、3μl SYBR Green和2μl引物混合物。底漆序列见表S1。采用CFX96或CFX384实时系统（C1000热循环器，Bio-Rad）进行qPCR，程序如下：95℃下1个循环（10min）；40个循环：95°C下15 s，60°C下1 min，72°C下1 min；1个循环：95°C下30 s，60°C下30 s，95°C下30 s。

线粒体应激试验和糖酵解应激试验

得到融合的单层膜，2×10⁵每个孔的细胞被放置在5个技术复制品中，用胶原涂层的XF96聚苯乙烯细胞培养微板（海马，安捷伦）在转基因中，并保持粘附过夜。然后，如结果所示，将细胞与二甲基亚砜或索拉非尼一起在GM或SM中培养，并在测量期间将这些试剂添加到所有后续培养基中。对于OCR测量，将保存在GM中的细胞洗涤并在含有1 mM丙酮酸钠、2 mM谷氨酰胺和25 mM的XF基培养基中培养d-将葡萄糖和保存在SM中的细胞洗涤并在含有5.5 mM葡萄糖的HBSS（无Hepes）中培养。对于ECAR测量，细胞在无糖DMEM（D5030，密理孔西格玛）中培养，并添加2 mM谷氨酰胺。使用XF96细胞外通量分析仪（Seahorse，Agilent，CA，USA）。仪器校准后，依次进行复方注射，包括寡霉素A（4μM）、羰基氰化物p-用三氟甲氧基苯腙（FCCP；0.2μM）和抗霉素A（2.5μM）检测线粒体呼吸。采用葡萄糖（10mM）、寡霉素A（1μM）和2-DG（50 mM）的顺序复合注射来测试糖酵解活性。OCR（以O的picomol表示₂每分钟）和ECAR（每分钟英里每分钟）值标准化为蛋白质含量。

线粒体膜电位测量

电池（5×10⁵)在6孔板中植入GM/collagen涂层圆玻璃，并放置过夜以附着。第二天，将培养基换成含载体（DMSO）或索拉非尼的GM培养基，培养2或6小时。未经处理的GM细胞作为对照。根据制造商的方案，使用四甲基罗丹明（TMRM；T668，Invitrogen）染色评估线粒体膜电位。在黑暗中用20 nM TMRM在37°C下培养20分钟，然后用PBS洗涤。这个?ψ_水户通过应用1μM FCCP获得该值。成像是在基于IX73 Olympus stage（IX73系统）、40×物镜和Retiga R1电荷耦合器件（CCD）相机（Teledyne QImaging）的倒置荧光显微镜上进行的。细胞在550nm处被激发，在600nm处被捕获。

丝裂原绿染色

电池（1×10⁶)在6孔板中植入GM/collagen涂层圆玻璃，并放置过夜以附着。第二天，将培养基换成含载体（DMSO）或索拉非尼的GM培养基，培养2或6小时。未经处理的细胞作为对照。细胞在37°C下用丝裂原绿（0.5μM）（M7514，Invitrogen）孵育3小时。在阵列共焦激光扫描显微镜（ACLSM）下观察线粒体结构，该显微镜基于蔡司观察者Z.1倒置显微镜，配备有YokogawaCSU-X1 Nipkow旋转盘系统，压电式z-axis机动舞台（CRWG3-200；日本东京新日铁株式会社）和CoolSNAP HQ2 CCD相机（Photometrics Tucson），使用100×物镜。细胞在488nm的波长下被激发，在516nm处捕获到发射。

葡萄糖摄取测量

电池（1.5×10⁶)在6孔板中植入GM/collagen涂层圆玻璃，并放置过夜以附着。第二天，用载体（DMSO）或索拉非尼将as培养基改为GM或SM，并将细胞培养2或6小时。未经处理的细胞作为对照。对于葡萄糖摄取分析，使用2-NBDG葡萄糖摄取标记物（Thermo Fisher Scientific）。在测量前，细胞在含有2 mM CaCl的缓冲液中葡萄糖消耗10分钟₂，135毫米氯化钠，5毫米氯化钾，1毫米氯化镁₂，1毫米Hepes，2.6毫米NaHCO_三0.44毫米KH₂人事军官₄0.34 mM磷酸钠缓冲液、0.1%维生素、0.2%必需氨基酸和1%青霉素/链霉素（Gibco），10分钟后，用0.1 mM浓度的2-NBDG涂在细胞上进行染色，并在37°C下培养30分钟，细胞用加载缓冲液冲洗三次，并在同一缓冲液中成像。成像实验是在一台ACLSM上进行的，它基于蔡司观察者Z.1倒置显微镜，配备了一个横河wacsu-X1 Nipkow旋转盘系统，一个压电的z-axis机动工作台（CRWG3-200；Nipphonpson Co.Ltd.）和CoolSNAP HQ2 CCD相机（Photometrics Tucson），使用40×物镜。葡萄糖摄取标记物2-NBDG的激发波长为488nm，发射波长为516nm。数据采集和控制使用VisiView Premier采集软件（2.0.8，Visitron系统）完成。在成像分析中，使用了变形（分子器件）。为了计算细胞液荧光信号的平均强度，首先，使用感兴趣的背景区域对ACLSM图像进行变形时的背景减去。变形软件通过设置细胞周围的区域并进行平均强度计算来应用。

免疫组织化学

根据手册使用Ki-67抗体（1ng/ml；M728；Dako），在抗原回收（120°C，pH9下7分钟）和过氧化物酶阻断（Dako）后，用福尔马林固定的石蜡包埋异种移植物进行免疫组化染色。对于显色反应，使用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）显色剂（Thermo Fisher Scientific）。所有载玻片均用苏木精复染。定量分析采用随机森林组织分类器，利用Halo图像分析平台（indicalabs）进行。采用苦味酸红染色法观察DEN处理小鼠肝癌结节的肝硬化情况。

蛋白质组学

小鼠源性异种移植肝癌肿瘤在RIPA缓冲液中用金属珠和LT组织分析仪（Qiagen）均质化。对样品进行超声处理（Branson Sonifier 3310 s超声波探头，10%输出），在14000 rpm下离心5分钟，并用双氰基乙酸（BCA）分析法（Thermo Fisher Scientific）定量。细胞培养样品（HepG2 WT和HepG2 KO）从RIPA缓冲液中的细胞培养孔中刮取并直接超声、离心和定量。用甲醇/氯仿方案沉淀每个样品的250μg(69)在100 mM tris（pH 8.5）和2%脱氧胆酸钠（SDC）中重组蛋白质颗粒，并在56°C下与5 mM TCEP/30 mM氯乙酰胺还原/烷基化10分钟。在37°C下用1:100 Lys-C和1:50胰蛋白酶对蛋白质进行蛋白质水解过夜。通过向最终产物中添加1%三氟乙酸来停止消化浓度0.5%。以14000 rpm离心10分钟除去沉淀的SDC，并在Oasis HLB平板（Waters）上对含有消化肽的上清液进行脱盐。在液相色谱-串联质谱（MS/MS）分析之前，将肽干燥并溶解在2%甲酸中。使用Ultimate3000高效液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific）与Q Exactive HF-x质谱仪（Thermo Fisher Scientific）在线耦合，对3000 ng胰蛋白酶肽混合物进行分析。缓冲液A由0.1%甲酸酸化的水组成，缓冲液B为80%乙腈和20%水加0.1%甲酸。首先将肽以30μl/min的速度，用100%缓冲液A（0.3 mm×5 mm，PepMap C18，5μm，100?；Thermo Fisher Scientific）捕获1分钟；捕获后，用50 cm的分析柱（Poroshell 120 EC-C18，2.7μm；Agilent Technologies）分离肽。在400nl/min的条件下，在155min内梯度为9-40%B。然后在10min内将缓冲液B提高到55%，并且在清洁步骤中增加到99%。使用1.9 kV的喷雾电压和275°C下加热的毛细管对肽进行电离。设置质谱仪以获得最大注入时间为120 MS、质量分辨率为120000和自动增益控制（AGC）目标值为3×10的全扫描MS光谱（350至1400质量/电荷比）⁶.选择了25种最强烈的前体离子进行MS/MS。HCD在HCD细胞中进行裂解，在Orbitrap质量分析仪中的读数分辨率为15000（隔离窗为1.4次），AGC目标值为1×10⁵最大注入时间为25ms，归一化碰撞能量为27%。

蛋白质组学数据分析

所有原始文件都由maxquantv1分析。6.17软件使用集成的Andromeda搜索引擎，仅针对细胞搜索人类UniProt参考蛋白质组（2020年10月发布75088个蛋白质序列），而对于异种移植，我们添加了小鼠UniProt参考蛋白质组（2020年10月发布，55489个蛋白质序列）(70).MaxQuant与标准参数一起使用（使用自动值选择“无标签量化”和“运行之间的匹配”），仅添加脱酰胺（N）作为变量修改。然后用Perseus v1进行数据分析。6.14：对“proteinGroups.txt”文件中报告的蛋白质进行过滤，以确定是否存在反向污染物和潜在污染物，并按现场进行鉴定。对于定量，我们使用MaxQuant计算的无标记定量，我们只保留每组至少两个生物复制品中发现的蛋白质；在异种移植中，我们去除了仅在小鼠Fasta中鉴定出的蛋白质。此时，Perseus使用自动设置（宽度0.3；下移1.8；模式，每列分别）对缺失值进行插补，得出5064个蛋白质用于方差分析（Benjamini Hochberg FDR，0.05），z得分（每行的平均值）和分层聚类。MS蛋白质组学数据已通过PRIDE保存到蛋白质交换协会(71)数据集标识符为pxd0222723的伙伴存储库。

体内实验

所有实验均按照欧洲指令2010/63/EU进行，并经奥地利联邦教育、科学和研究部批准。小鼠被安置在标准的12小时光照/12小时黑暗周期下。首先将索拉非尼溶解于二甲基亚砜（120 mg/ml），然后在聚乙二醇（PEG）400:PBS（1:1）中稀释，最终工作浓度为3 mg/ml。小鼠通过口服灌胃给予索拉非尼（30 mg/kg）。

异种移植试验

HepG2 WT或KO细胞（2×10⁶)1周龄雄性大鼠（1～1周）双侧注射NMRI:1:100-狐狸1^努老鼠。^三将小鼠随机分为4组(n=6至10个/组），在自由饮食（Altromin 1320强化）或定期禁食的组中，通过口服灌胃给予溶媒对照品[DMSO，PEG 400:PBS（1:1）]或索拉非尼，这意味着小鼠每周两次禁食24小时（随意获取水和水凝胶），两到三天的自由再喂养。索拉非尼或溶媒对照组在再喂养阶段开始时应用，浓度为30 mg/kg。在第二个实验中，一旦肿瘤可以测量，老鼠被随机分为四组(n=6-10/组），通过口服灌胃给予溶媒对照品[DMSO在PEG 400:PBS（1:1）]或索拉非尼，这些组保持自由饮食（Altromin 1320强化）或喂养FMD，可随意获得水和水凝胶。在FMD周期之间，小鼠被自由饮食5天。方案重复4个周期。在喂食浓度为60mg/kg的口蹄疫开始和结束时使用索拉非尼或溶媒对照。FMD从Prolon购买，并按已出版的格式编制(25)第1天的平均卡路里摄入量为50%，第2天为平均卡路里摄入量的10%。所有小鼠的平均食物摄入量是根据它们提前1周的标准食物摄入量计算的。

每周用卡尺测量一次异种移植物，肿瘤体积计算公式如下：五=（4/3）×π×(左/2） ×(左/2） ×(W/2） ，与左长度（较短尺寸）和W宽度（较长尺寸）。在第四个禁食周期结束时，再喂养小鼠3-4天，然后处死。一些老鼠在禁食24小时后被处死。

双转基因小鼠

Tp53型^{絮状物/絮状物}C57BL/6J小鼠与CreER杂交^T2型+/?C57BL/6J小鼠产生Tp53^{絮状物/絮状物}克里尔^T2型+/?小鼠和相应的Tp53^{絮状物/絮状物}克里尔^T2型?/?控制装置(46).

试点试验

为了确定最有效的定期禁食方案和安全的索拉非尼浓度，进行了初步试验。在第一个试验中，C57BL/6J小鼠(n=6/组），禁食24小时，中间再喂养48小时，而在第二个试点实验中，C57BL/6J小鼠(n=7/组）每隔一天禁食一周。每日测量食物摄入量和体重。对于核磁共振测量，在动物被处死前，即最后一天禁食后，从下颌下静脉采集血液。将100至300μl血液与10μl EDTA混合，并在室温下最多保持30分钟。然后，将样本在4°C、3500 rpm下离心10分钟。将血浆转移到干净的试管中并储存在?80°C直到测量。

第三个试验是为了评估索拉非尼的肝脏毒性。C57BL/6J小鼠(n=6/组），或口服索拉非尼10、30或50 mg/kg，每周三次，连续四周。小鼠每周称重两次（灌胃时）。实验结束后，处死小鼠，肝片福尔马林固定，石蜡包埋，以作进一步分析。

间质液分离及血糖测定

小鼠颈椎脱位处死后2min内解剖异种移植物。称重，在PBS中短暂洗涤，置于一个50毫升试管上具有20μm孔（pluriStrainer，20μm，Pluriselect）的细胞筛上，在300℃下离心g在4°C下保持10分钟。收集通过间质液体的流量（每个异种移植5到100μl）。根据制造商的说明，用葡萄糖比色/荧光测定试剂盒（Merck）测量间质液中的葡萄糖浓度。每次测量使用5微升的间质液。用Accu-Check-Guide血糖计（Roche）通过尾静脉穿刺测量血糖。

核磁共振代谢产物分析

为提取极性代谢物，向70μl血浆中加入140μl冰镇甲醇，摇匀混合，储存于?20°C，持续1小时。试管在13000 rpm下离心30分钟（4℃），上清液转移到新鲜试管中，并冻干样品。对于NMR实验，样品在500μl NMR缓冲液{0.08 M磷酸钠缓冲液、5 mM TSP[3-（三甲基硅烷基）丙酸-2,2,3,3-d4钠盐]、0.04%（w/v）NaN中再溶解_三在重水中，用8mhcl和5mnaoh}将pH调节到7.4。血浆代谢分析是在310K下使用配有TXI探针头的Bruker Advance Neo 600 MHz核磁共振波谱仪进行的。采用Carr-Purcell-Meiboom鳃脉冲序列进行采集¹H抑制水预饱和的一维核磁共振谱（cpmgpr1d，512次扫描，F1中73728个点，12019.230 Hz谱宽，1024个瞬态，循环延迟4s）。核磁共振波谱数据处理如前所述(72)很快，数据在Bruker Topspin版本4.0.2中使用FID的一维指数窗口乘法、傅里叶变换和相位校正进行处理。然后将核磁共振数据导入Matlab2014b，将TSP用作化学位移参考的内部标准（设置为百万分之0），排除水、TSP和甲醇信号周围的区域，对齐NMR光谱，并进行概率商归一化。代谢物的定量采用归一化光谱的信号积分法。

双转基因小鼠肝癌模型的建立

DEN（N0756，Sigma-Aldrich）在0.9%无菌NaCl中稀释至2.5 mg/ml的工作浓度^T2型+/?还有克里尔^T2型?/?Tp53型^{絮状物/絮状物}C57BL/6J小鼠在2周龄时接受DEN（25mg/kg，i.p.）。41至43周后，在发生肝癌后，小鼠连续5天口服他莫昔芬（100 mg/kg），然后进行1周的冲洗期。在90%花生油和10%乙醇中新鲜制备他莫昔芬（Molekula）作为工作溶液（30mg/ml）。然后，进行4个周期的治疗：周期性禁食组小鼠随机喂食或每周禁食2次，持续24小时。两组均口服索拉非尼（30mg/kg），每周两次，禁食组在禁食后24小时禁食后，同一天喂饲组。在4个周期和另外2-3天的随意喂养后，处死小鼠。称重整个肝脏，然后从肝脏中分离出所有肝癌结节并一起称重，以评估肿瘤的总重量。

超声波

简单地说，用异氟烷麻醉小鼠（2升/分钟₂4%异氟醚麻醉室；2升/分钟₂，2%异氟醚在麻醉面罩中成像）。麻醉动物被剃光，躺在工作台上固定。使用Vevo 3100（FUJIFILM VisualSonics）进行超声成像。

肝生物化学

肝板条（美纳里尼SPOTCHEM II，Liver-1 33925）用于小鼠血浆中LDH、AST、ALT、白蛋白、总蛋白和总胆红素的定量测定（SPOTCHEM EZ SP-4430 Arkray Inc.）。简单地说，在动物被处死之前，从下颌下静脉采集血液。将100至300μl血液与10μl EDTA混合，并在室温下放置最多30分钟。然后，将样本在4°C、3500 rpm下离心10分钟。将血浆转移到干净的试管中并储存在?80°C直到测量。对于面板测量，加载70μl的等离子体。

统计分析

如果没有特别说明，所有实验至少独立进行三次。使用GraphPad Prism 8（GraphPad软件）进行统计分析。统计上的显著性差异如图图例所示。如果未另行说明，数据代表平均值±SEM，具有以下统计显著性等级：*Ptrans data-src=" 0.05, **"<0.05**Ptrans data-src=" 0.01, and ***"<0.01，以及***Ptrans data-src=" 0.001. "<0.001。统计蛋白质组学分析（ANOVA，z评分和等级聚类）使用Perseus v1进行。6.14.0款(73).