蛋白质设施用户揭示自噬受体蛋白招募自噬起始相关ULK复合物分子机制

　　

       细胞自噬（Autophagy）是真核细胞中一种高度受调控的、溶酶体依赖的细胞代谢过程，对于维持细胞内稳态以及促进细胞的生长、发育和存活具有至关重要的作用。选择性自噬通过自噬受体蛋白来特异性地识别和降解特定的底物，包括蛋白聚集体、受损线粒体、外源性的入侵病原体等。选择性自噬在众多的生理过程中扮演着重要的角色，其功能异常也与大量的人类疾病相关联，比如，神经退行性疾病和微生物感染等。在哺乳动物细胞中，自噬起始ULK复合物由ULK1、ATG13、ATG101、FIP200四个亚基组成，其在启动自噬体形成的初始阶段发挥关键作用。在一些选择性自噬过程中，自噬受体蛋白可通过结合ULK复合物中的FIP200亚基来招募和激活ULK复合物，并在自噬底物附近原位介导自噬体的形成。但是，目前自噬受体蛋白通过结合FIP200来招募ULK复合物的分子机理和相关的调控机制仍然未知。

        2021年3月10日，国家蛋白质科学研究（上海）设施用户中科院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室的潘李锋课题组在Nature Communications发表了题为“Phosphorylation regulates the binding of autophagy receptors to FIP200 Claw domain for selective autophagy initiation”的文章，揭示了一种普遍的、可受磷酸化调控的自噬受体蛋白结合FIP200的Claw结构域来招募自噬起始ULK复合物的分子机制。该团队通过核磁共振技术、快速蛋白液相色谱、分析型超速离心、荧光偏振实验等一系列生化表征手段，首次发现参与内质网选择性自噬的自噬受体蛋白CCPG1的FIR2基序区间的104位丝氨酸的磷酸化修饰会显著增强CCPG1 FIR2与FIP200 Claw结构域之间的相互作用。同时，该团队进一步的研究发现TBK1激酶介导的自噬受体蛋白Optineurin（参与介导蛋白聚集体、入侵病原体、受损线粒体的选择性自噬过程）的LIR基序的177位丝氨酸的磷酸化会调控和增强Optineurin LIR与FIP200 Claw之间的相互作用。随后，通过X射线单晶衍射方法，该团队首次解析了FIP200 Claw分别结合磷酸化的CCPG1 FIR2 （p-CCPG1 FIR2）和磷酸化的Optineurin LIR（p-Optineurin LIR）的高分辨复合物结构。与生化结果一致，相关的结构分析显示FIP200 Claw以稳定的二聚体存在，并对称地结合两个磷酸化的CCPG1 FIR2或Optineurin LIR形成异源四聚体，后续详细的结构分析不仅首次揭示了p-CCPG1 FIR2和p-Optineurin LIR结合FIP200 Claw的具体分子机制，而且发现磷酸化修饰调控CCPG1 FIR2和Optineurin LIR与FIP200 Claw之间相互作用的机制是不同的。

图1：FIP200 Claw结合磷酸化的CCPG1 FIR2和Optineurin LIR的生化和结构数据

 

       基于解析的复合物结构和相关的生化研究，该团队首次定义了可结合FIP200 Claw结构域的FIR基序的序列模式，并通过生物信息学分析发现大量自噬受体蛋白的经典LIR区间包含了潜在的FIR基序，随后研究人员将目前已知的和潜在的FIR与FIP200 Claw的相互作用系统归纳为两种不同模式。同时，进一步的结构分析和生化实验表明CCPG1 FIR2或Optineurin LIR可以通过相同的氨基酸残基竞争结合FIP200 Claw和ATG8家族蛋白，表明自噬受体蛋白在识别自噬底物后应该先通过结合FIP200招募ULK复合物，然后原位介导自噬前体的产生，后续再通过结合ATG8家族蛋白来促进自噬前体的延伸和闭合过程。最后，研究人员提出在选择性自噬过程中自噬受体蛋白通过结合FIP200亚基来招募自噬起始ULK复合物来介导自噬体形成过程的模型图。

图2. 选择性自噬过程中含FIR/LIR的自噬受体蛋白招募ULK复合物和ATG8家族蛋白介导自噬体形成的卡通示意图

       

        综上所述，该研究工作首次系统定义了可结合FIP200 Claw结构域的FIR基序的序列类型，并揭示了一种普遍的、可受磷酸化调控的自噬受体蛋白结合FIP200 Claw结构域来招募自噬起始ULK复合物的新机制，对进一步理解自噬受体蛋白介导的选择性自噬过程具有重要的指导性意义。

        国家蛋白质科学研究（上海）设施质谱分析系统利用质谱分析鉴定到了该课题关键蛋白Optineurin的177位丝氨酸的磷酸化受到TBK1激酶调控，为后续机制研究提供了重要的支持。