SMARTer RACE技术在CAR-T研究中的应用

随着免疫检查点阻断药-纳武利尤单抗注射液（欧狄沃Nivolumab）的出现，癌症免疫疗法近年来受到了很大的关注。此外，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T），作为划时代新免疫疗法的一种也备受期待。本文主要介绍在抗体医药及CAR-T疗法等领域被更加频繁使用的SMARTer RACE 5’/3’ Kit的技术，同时传递使用本kit用于CAR-T研究相关的论文信息。

关于CAR-T疗法

所谓CAR-T疗法，是通过基因工程技术使T细胞表达嵌合抗原受体（CAR），改造后的T细胞（CAR-T）重新回输到病人体内对自身的癌细胞进行治疗的方法。CAR是由“抗体的抗原识别区”和T细胞受体的“细胞内信号传导区”连接形成的嵌合蛋白质。导入CAR的T细胞（CAR-T）能够识别并攻击癌细胞特异的蛋白质（抗原）。为制备CAR，需要克隆癌细胞特有的针对抗原的抗体“可变区域”。

Takara Bio的SMARTer RACE 5’/3’ Kit（Code No. 634858/59）是能够快速克隆抗体可变区域的试剂盒。

试剂盒基本原理

本产品是利用SMART技术的RACE（Rapid amplification of cDNA ends）用试剂盒，不需要连接接头即可实现cDNA的合成。合成之后的cDNA，由于可直接用于5’RACE PCR或3’RACE PCR，因此仅通过简单的操作即可克隆抗体的可变区域。CAR-T等T细胞疗法也可以使用该产品。

试剂盒操作流程

· 不需要RNA的前处理：即使有gDNA混入时，也不需要使用DNase进行前处理。

· 1st strand cDNA合成开始至RACE片段的克隆，只需8小时即可完成。2天可完成DNA的回收。

• SMARTer RACE 5’/3’Kit应用于抗体可变区的调取

小鼠杂交瘤来源抗体基因的快速克隆 — 在克隆小鼠杂交瘤抗体基因之前，首先根据NCBI核酸数据库注册的小鼠lgG的序列，设计了针对H链, L (κ)链, 或L (λ)链的反转录引物（RT primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5’ RACE primer）。通过SMARTer RACE方法从total RNA合成了第一链cDNA后，直接进行5’-RACE PCR，这样不仅可以获得5’端序列，还可以获得带有可变区全部序列的cDNA片段。

图1. 使用SMARTer RACE 试剂盒对抗体可变区进行5’ RACE PCR的实验流程

培养并确认小鼠杂交瘤细胞分泌由γ2a型重链和κ型轻链组成的单克隆抗体。提取total RNA，按照说明书protocol进行第一链cDNA合成和5'-RACE PCR，取一部分PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳确认。

图2. 确认小鼠杂交瘤中抗体基因的成功扩增.

克隆扩增产物至pUC118后测序。确认序列包含单克隆抗体H链和L链N端氨基酸序列对应的ORF。

我们对其他六种杂交瘤细胞系的抗体可变区进行同样的基因序列分析。获得了所有抗体亚类的PCR产物。分析序列后显示，90%的H链克隆和50%的L链克隆序列准确编码目标抗体蛋白质N端氨基酸序列。

文献信息：免疫疗法研究相关的应用例

◇ CAR-T相关应用：骨髓移植时减轻排斥反应的效果

Arai Y., et al. (2018) Myeloid Conditioning with c-kit-Targeted CAR-T Cells Enables Donor Stem Cell Engraftment. Mol Ther. 26(5):1181-1197.

利用靶向C-kit（造血干细胞因子特异的酪氨酸酶受体）的CAR-T细胞，通过对慢性肉芽肿病（CGD*）小鼠的骨髓进行前处理，然后移植正常小鼠来源的骨髓，已确认移植小鼠的活性酶ROS的产生得到改善。

* CGD（Chronic Granulomatous Disease：引起吞噬细胞的活性酶（ROS）产生障碍的遗传性免疫缺陷

◇ T细胞免疫治疗的相关应用：同种造血干细胞移植后，防止白血病复发

Dossa RG., et al. (2018) Development of T cell immunotherapy for hematopoietic stem cell transplantation recipients at risk of leukemia relapse. Blood, 131(1):108-120.

为防止同种造血干细胞移植后白血病的复发，将与小型组织适合抗原（HA-1）有很高亲和性的TCR携带表达Retrovirus vector导入到HA-1阴性T细胞，in vitro实验确认效果。

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