技术连载之2：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

您有没有考虑过基因编辑小鼠模型应用中会有哪些常见风险？是否会对结果分析造成哪些影响？业界重量级资深技术大咖进一步为您详细解析：Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素。精彩好文，全是干货，不可错过！

　　

作者：俞晓峰  赛业生物首席科学家/中国区副总裁

      应用基因编辑小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病机制过程，为药物研发的临床前研究，发挥了不可取代的作用。Cre-loxP位点特异性重组系统（简称Cre-loxP重组系统）的建立，为完善基因编辑小鼠模型的构建，进一步开展条件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顾Cre-loxP重组系统在小鼠研究中的实际应用，研究者们认识到，对该技术应用中存在的某些风险与影响因素，给予充分了解与关注，将有助于提升靶基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。

文章亮点
一、Cre-loxP位点特异性重组系统应用基本原理
二、应用Cre-loxP位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究
三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点
四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征
五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性
六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素
七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

正文续前

六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素
1. Cre非特异性/错误重组作用/随机插入突变的影响因素
2. Cre重组酶高表达的毒性作用
3. Cre生殖系重组作用与小鼠性别影响
4. Cre作用的镶嵌现象 (Mosaicism)
5. 小鼠遗传背景影响作用
6. TAM应用中相关问题：关于TAM有效诱导的最优剂量与途径  及 TAM诱导毒性

      Cre小鼠模型作用的一致性与可重复性，是分析解释实验结果可靠性的保证。然而，回顾过去研制的一些Cre小鼠模型，观察分析其实际应用中的情况发现，不少所谓特异性Cre小鼠模型，其Cre的靶基因切割活性，明显存在不均匀和/或不一致的现象。比如，MMTV-Cre、Krt19-Cre、Gata4-Cre和Nes-Cre/ERT2小鼠等, 都报道有不同程度泄露表达等非特异性作用效果。 

      某些Cre小鼠模型，常出现Cre非特异性/非预期/异位等异常表达现象， 从而影响表型结果分析及解释的准确性。比如，Myh6-Cre、Ins2-Cre、Vil-Cre、Ddx4-Cre和Pdx1-Cre等。也有些Cre小鼠模型表现有生殖系细胞作用活性，从而引起Cre-loxP重组系统的广泛而非特异性的切割作用。

      关于Cre小鼠的所谓非特异脱靶重组作用的原因，目前多认为，与如下因素有关，第一，应用不同的Cre小鼠构建策略与技术；第二，Cre小鼠起初研制的时候，研制者很明确其实际应用的特殊目的，从而导致对Cre小鼠特征鉴定的关注点存在偏差，忽略了对其进行全面完整而系统的相关分析。然而，当这些Cre小鼠模型成为公共应用资源后，由于研究者们的广范围应用，也使人们有更多机会对其期望作用的靶组织，以及作用范围区域和多个时间点的细胞/组织类型等重组切割活性，进行更加精确及深入的实验研究。

      Cre小鼠令人困惑的潜在非特异性作用的脱靶活性风险，以及引起可能的毒性作用，不仅可导致靶基因敲除小鼠的死亡，或非靶基因敲除引起的非特异性表型。由于这类Cre小鼠引起的脱靶活性作用，其实已代表了Cre的真正活性作用，自然也限制了这类小鼠模型，未来进一步应用的价值。

1. Cre非特异性/错误重组作用/随机插入突变的影响因素

      目前常用的Cre小鼠模型多为传统转基因技术构建，即采用所谓细胞/组织特异性的启动子部分DNA片段策略，加上基因随机插入，可能产生所谓的基因表达位置效应等特征，造成Cre表达的不准确或泄漏，难以真实反映真正期望的特异性，导致Cre表达出现脱靶切割作用。

      有研究通过分析常用的几种胸腺特异性Cre转基因小鼠模型（比如Lck-Cre, CD2-Cre和CD4-Cre）的非特异性作用时发现，虽然这些小鼠均是应用胸腺特异性启动子构建的，但Cre表达，可导致小鼠胸腺细胞量中等或严重程度的减少，且表现有剂量和拷贝数量依赖的特征。

      由于Cre重组酶非特异性识别并作用于基因组中与loxP位点相似的序列，也称隐秘loxP（cloxP) 位点，引起Cre-cloxP位点的非特异性重组切割作用，从而有可能导致重要或关键基因破坏，轻则引起非特异性细胞表型，重则研究组织器官破坏或小鼠死亡。 

      对Tek-Cre小鼠模型进行基因插入位点分析研究表明，由于Cre的随机插入，导致241-kb大小DNA缺失, 影响到相关蛋白编码基因（比如Mtrr、Fastkd3和Adcy2等）表达， 且小鼠出现发育异常的表型，而该表型可能与Mtrr基因的缺失有关，因为Mtrr基因敲除小鼠，即可导致后代小鼠发育严重障碍。

      另外，在分析某些Cre转基因（比如Ins2-Cre、Nes-Cre、Alb-Cre和Lck-Cre）小鼠模型也发现，某些非预期DNA成分出现，比如，人生长激素 (hGH) 微小基因片段。并观察到Nes-Cre和Ins2-Cre两种小鼠品系都出现代谢方面的明显表型，且Ins2-Cre小鼠出现不明原因的，与年龄相关的糖耐受异常。但Alb-Cre和Lck-Cre两种小鼠品系，却未见相似表型。表明hGH微小基因在不同转基因小鼠中，可表现不同的表达及影响作用。

      也有报道发现，在分析的40种转基因Cre小鼠模型中，有10种Cre小鼠伴随有E.coli DNA序列的污染，DNA片段大小由～300 bp到超过200 kb。且证实，小DNA片段与克隆载体如pBACe3.6相同。出现细菌和载体DNA相互污染的推测原因，可能与注射载体DNA制备过程有关。但关于此类污染的影响作用，目前还不太明确。但有研究报道，细菌DNA序列可沉默及影响转基因的表达。

      一般认为，随机插入转基因构建Cre小鼠模型的策略与技术，存在许多不确定的风险。比如，Cre随机插入，干扰附近内源基因表达水平，从而导致Cre作用的所谓脱靶表达现象。

      即使应用定点敲入策略构建Cre小鼠模型，也可能造成相应基因表达影响，导致该小鼠模型出现一定的病理改变表型。特别是采用将Cre敲入内源基因的5’端构建策略。比如，Foxg1-Cre敲入/敲除小鼠，就是在Cre敲入内源性Foxg1基因位点同时，也敲除了该基因，而 Foxg1基因参与小鼠大脑半球发育过程，所以，该Cre纯合子小鼠在围产期死亡。 虽然，Foxg1- Cre杂合小鼠，仍可发挥脑部组织特异性靶向作用，实现小鼠大脑半球、视前/视囊泡、嗅觉上皮神经和咽囊部等部位靶基因特异性敲除的目的。 

2. Cre重组酶高表达的毒性作用

      Cre重组酶在细胞内的大量蓄积，可直接引起DNA破坏及细胞死亡。研究已表明，对于高表达Cre的转基因小鼠，表现为其存活及繁殖能力降低。CAG-Cre和CD2-Cre小鼠模型就是典型例子。

      Myh6-Cre小鼠是心肌特异性常用小鼠模型, 借助aMyHC启动子及随机插入转基因的策略构建而成。对比小鼠Cre不同表达水平的影响作用发现，Cre高表达小鼠发生非特异性重组作用，从而影响到小鼠心肌的正常功能。而Cre低表达转基因小鼠，则无非特异性重组作用。研究者认为，高表达的Cre与小鼠体内某些所谓隐秘loxP(cloxP)位点，发生非特异性的重组切割效应，达到破坏相关基因功能的作用。

      神经元细胞中高表达的Cre可引起小鼠脑发育受损。研究分析Nestin-Cre和两个Nestin-CreERT2转基因小鼠品系证实， 所有纯合Nestin-Cre小鼠，都有胚胎发育延迟及神经元增殖降低、异倍体增加与细胞凋亡病理现象、最终导致小鼠小脑症和脑积水等发育缺陷表型。

      高水平Cre表达也可直接影响视网膜色素上皮细胞功能。比较分析不同视网膜色素上皮细胞 (RPE) 特异性Cre转基因小鼠后发现，常用Trp1-Cre转基因小鼠本身，就伴随RPE单层细胞结构混乱、RPE区域萎缩、视网膜感光细胞功能丧失、以及小胶质细胞激活等病理变化。

      作为代谢性疾病常用的RIP (Ins2)-Cre小鼠，也见有糖耐受反应或诱发糖尿病发生，并推测可能与胰岛素分泌受损有关。

      有报道表明，诱导性肠特异性Villin-CreERT2小鼠，经TAM激活后，可借助隐秘loxP位点，引起非特异性DNA破坏作用。

3. Cre生殖系重组作用与小鼠性别影响

      通过对64种不同神经系统相关Cre小鼠模型研究发现，有64.1%小鼠有生殖系重组作用，且29种(占82.8%) 有性别差异，其中父本Cre小鼠有完全或选择性生殖性重组活性作用占62.1%，而母本Cre小鼠则只占20.1%。只有17.2%的Cre小鼠，具有相似的生殖系重组作用。 比如，Foxg1-Cre/floxed 双基因编辑雄性小鼠与野生雌性小鼠交配的后代，会出现有一定程度生殖细胞基因敲除现象（68.8%），但未见Foxg1-Cre雌性小鼠的生殖细胞作用。

      分析这些Cre小鼠出现生殖系重组作用的可能原因及其影响因素，包括小鼠模型构建策略技术本身，比如，转基因还是定点敲入策略、启动子的选择、Cre插入位点及表达水平、5’ 端还是3’端敲入、IRES与2A连接方式等都可为潜在影响因素。比如，所谓内皮细胞特异性Tek-Cre (Tie2-Cre)转基因小鼠模型，多是借助Tek基因的2.1 kb启动子加10 kb内含子片段区域构建而成。结果发现，该Cre表达活性出现于小鼠胚胎7.5天，且表现一定程度造血干细胞系的重组活性。且母本小鼠显示有明显的生殖系重组作用。现已证实，因Tek基因调控序列在胚胎发育过程及生殖系细胞具有活性作用，从而引起了靶基因在生殖系被敲除的结果。

4. Cre作用的镶嵌现象 (Mosaicism)  

      由于变化或不一致的Cre表达作用，导致同一小鼠体内不同细胞或组织中，Cre重组切割作用活性及效率表现差异，因而引起靶基因在不同细胞或组织被敲除的效果，呈现不一致的现象。比如，Vav1-Cre或Fabp4-Cre小鼠品系，其Cre小鼠作用的子代同窝小鼠中，因Cre作用引起的遗传改变相关表型，也存在差异的可能性。另外，EIIa-Cre小鼠作为常用的广泛细胞组织靶基因完全敲除的工具，实际应用中也被证实，雄性Ella-Cre小鼠明显有镶嵌表达的特性，而雌性Ella-Cre小鼠的重组切割活性, 则更加均匀一致。因而建议用雌性Ella-Cre小鼠与条件性靶向(floxed) 雄性小鼠进行交配，以获得更为理想而完整的重组切割效果。

5. 小鼠遗传背景影响作用

      研究已发现，不同遗传背景的同一Cre小鼠模型，其重组切割活性作用也可不同。比如，眼睛特异性Le-Cre转基因小鼠所引起的眼睛异常表型，就与其遗传背景的影响有关。当该Cre小鼠常用FVB/N品系与CBA/Ca遗传背景小鼠交配7代后，部分CBA/Ca品系的Le-Cre小鼠，出现明显眼睛异常表型。且CBA/Ca品系小鼠眼睛表型的严重性及出现频率，也可通过回交FVB小鼠2代而逆转消除。

6. TAM应用中相关问题

      CreERT2-loxP位点特异性诱导性重组系统，需要诱导剂TAM参与完成。然而，实际应用中，有许多因素可影响其作用效果，并可能引起非特异性及相关毒副作用，则应加以了解关注与重视。

（1）关于TAM有效诱导的最优剂量与途径

      通过对已报道的CreERT小鼠品系应用研究分析中，寻找最佳TAM诱导有效性是比较困难的，部分原因是因为不同研究，应用了不同的实验方案策略与操作流程，包括多种不同的TAM制备及使用剂量，各种给药途径等。比如，Columbia大学对相关研究者们的问卷调查表明，TAM制备方法（玉米油配制为多，其次为向日葵油和花生油等）、使用剂量（20mg～175 mg等）、给药途径及次数（腹腔注射最多，包括有单次、2-4次和5次等，其次为口服灌胃等）、以及诱导效果检测方法（RT-PCR和免疫荧光染色为主）等均有明显不同。

      虽然，目前大部分研究都是采用TAM腹腔注射（IP）给药的方式，但也有研究比较了IP给药与口服灌胃（PO）给药方式效果，发现PO方式在降低TAM毒性方面，可能更有优势。且发现老年CreERT小鼠，往往需要更高剂量与更长时间TAM诱导，以获得满意的CreERT作用活性。

      关于最佳TAM有效诱导剂量与给药途径，目前的相关知识仍很有限，需要继续探索与积累。也建议研究者根据实际具体情况，筛选出适合研究计划的最佳剂量与途径。

（2）TAM诱导毒性

      目前已经明确，高剂量腹腔给药TAM，有长期毒性作用，可增加小鼠发病及死亡率。比如，广泛诱导性R26CreERT2小鼠，如果使用高浓度TAM（175 mg/kg, 口腔连续5天）诱导，小鼠出现胸腺萎缩、严重贫血、以及造血细胞异常染色体重排等造血系统相关毒性反应。

      也有研究发现，心肌特异性诱导表达的MerCreMer (MCM) 转基因小鼠，经中高剂量TAM（60～90 ug/g, 腹腔连续3～5天）处理后，~60-80%的MCM小鼠出现心脏纤维化，且伴有促炎症细胞因子表达的增加,  最终导致心脏功能衰竭及小鼠死亡。但减少TAM诱导使用剂量或次数（比如30 ug/g，腹腔连续3天给药），不仅可以实现Cre特异性重组作用的最大化（～84%），且最低程度降低其心脏毒性作用的效果。同时，建议应用TAM处理的MCM小鼠作为实验对照。

      进一步分析MCM小鼠CreERT转基因插入位点证实，该MCM转基因插入到小鼠基因组染色体19的C1区域，导致约~20 kb基因组片断缺失，该片断包含A1cf基因外显子1及部分内含子1区域。

      关于TAM诱导MCM小鼠心脏毒性的可能原因，相关研究认为，TAM诱导的心脏纤维化及心脏衰竭，不是由于MCM的随机插入位点及TAM使用剂量本身的高低引起的，而是因为中高剂量TAM诱导作用，使Cre表达相应增加，从而引起可能的Cre与cloxP隐秘位点的非特异性重组切割有关。因为，（1）不同年龄的MCM小鼠本身未见心脏纤维化现象；（2）同样高剂量TAM诱导野生B6小鼠，未见小鼠心脏纤维化改变；（3）高剂量TAM可引起MCM小鼠体内心肌细胞程序性死亡增加，且可能与DNA破坏激活及p53基因稳定性下降有关；（4）体外原代细胞证实，高表达Cre重组酶，能直接引起细胞的程序性死亡。

      有研究对不同策略构建（随机插入和定点敲入）的两种诱导性CD4-CreERT2小鼠品系比较分析，通过将其分别与纯合Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP报告小鼠进行交配，TAM诱导后，观察体内T滤泡辅助细胞（Tfh) 动态适合反应，并用不完全蛋白偶联的NP-KLH抗原免疫小鼠，以诱发辅助性Tfh细胞的分化。结果发现，高表达CD4-CreERT2随机插入转基因小鼠，可降低了辅助性Tfh细胞分化数量，干扰了细胞的存活。而低表达CreERT2的定点敲入小鼠， 则能避免因Cre表达过高造成的细胞损失作用，且仍能有效发挥其淋巴细胞特异性重组效率。

      前面介绍的TAM诱导的毒性作用研究报道，多与高剂量TAM使用及高表达Cre作用相关。但最近有研究表明，低剂量TAM（20 mg/kg）诱导也会影响小鼠骨形成。研究者采用不同剂量TAM（0、20、40和200 mg/kg，腹腔连续4天）诱导4周龄野生B6小鼠，结果表明，20 mg/kg剂量TAM诱导，即可引起小鼠股骨体积比（骨体积/总体积）增加153%。因此提示，即使应用非常低剂量的TAM诱导，在实际CreERT骨特异性靶基因敲除/表达的研究中，也需要考虑TAM诱导可能影响到小鼠骨小梁和皮质骨的形成过程。（未完，精彩后续内容请点击继续阅读）

前后连载

技术连载：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议