技术连载：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

基因编辑小鼠模型是当今研究基因功能和致病机制的利器。业界重量级资深技术大咖为您详细解析：为何应充分了解与关注基因编辑小鼠模型应用中存在的某些风险与影响因素，如何设计有助于提升基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。精彩好文，全是干货，不可错过！

作者：俞晓峰  赛业生物首席科学家/中国区副总裁

    应用基因编辑小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病机制过程，为药物研发的临床前研究，发挥了不可取代的作用。Cre-loxP位点特异性重组系统（简称Cre-loxP重组系统）的建立，为完善基因编辑小鼠模型的构建，进一步开展条件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顾Cre-loxP重组系统在小鼠研究中的实际应用，研究者们认识到，对该技术应用中存在的某些风险与影响因素，给予充分了解与关注，将有助于提升靶基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。

文章亮点
一、Cre-loxP位点特异性重组系统应用基本原理
二、应用Cre-loxP位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究
三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点
四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征
五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性
六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素
七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

正文

一、Cre-loxP位点特异性重组系统应用基本原理

      所谓Cre-loxP位点特异性重组系统，源于噬菌体P1中，存在Cre重组酶（343个氨基酸蛋白，4个亚单位组成）及其能特异识别的一对34 bp的DNA序列（即loxP位点），并根据两个loxP位点的方向性，将两loxP位点之间的DNA序列（也称floxed区域）进行特异性重组切割或反转。 

      如果在相应细胞/组织内特异性表达Cre重组酶,  且细胞/组织内也含两个loxP位点序列的floxed靶区域，则可使Cre-loxP系统的重组作用，局限于特定细胞或组织，实现体内靶基因特异性敲除或表达的目的。 T细胞特异性Cre转基因小鼠最先构建，为条件性靶基因在T细胞中的功能研究提供了条件。

二、应用Cre-loxP位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究

      要想实现小鼠条件性靶基因编辑及功能相关研究，前提是分别获得两种小鼠模型：即构建含两个loxP位点序列floxed靶基因的小鼠和细胞/组织特异性表达Cre小鼠。 比如，为了开展某靶基因的条件性敲除（CKO)研究, 首先要构建该靶基因的打靶载体，即将两个loxP位点分别克隆到该靶基因DNA区域的两端，再借助CRISPR/Cas 受精卵注射或赛业生物TurboKnockout囊胚注射技术，建立所谓的靶基因floxed小鼠，即小鼠模型在某靶基因计划敲除的特定floxed区域，已经携带了两个同向的loxP位点。将该floxed小鼠与某特定细胞/组织特异性表达的Cre小鼠进行交配，就能获得该靶基因在此特定细胞/组织敲除的小鼠模型。

      最终完成Cre-loxP系统条件性靶基因编辑小鼠研制的操作，通常需要通过floxed小鼠与相应Cre小鼠间的两步遗传交配繁殖过程。第一步交配，X基因Cre杂合小鼠（X基因Cre/+）与Y基因 floxed杂合小鼠（Y基因 lox/+，即CKO打靶Y基因)，或Y基因 floxed纯合小鼠（Y基因lox/lox）交配，获得X基因Cre/+; Y基因lox/+ 后代杂合小鼠。第二步交配，将X基因Cre/+; Y基因lox/+杂合小鼠，再与Y基因lox/+杂合小鼠，或Y基因lox/lox纯合小鼠交配，从而获得最终X基因Cre/+；Y基因lox/lox条件性打靶小鼠。

       如果Cre表达是严格调控的，且无生殖系统或发育过程表达现象，第二步交配的后代小鼠, 只有X基因Cre/+; Y基因lox/lox小鼠，可作为条件性靶基因打靶的小鼠模型研究，即Y基因的两个等位基因，在Cre重组酶特异性表达活性的组织细胞中，被有效重组切割的目的。

      然而，如果Cre存在生殖系统泄露表达情况，在第一步交配后，有可能对X基因Cre/+; Y基因lox/+杂合小鼠，进行生殖性重组切割作用，产生X基因Cre/+; Y基因Δ/+小鼠（Δ代表Y基因某个等位基因在某些细胞或所有细胞敲除），这样的话，第二步交配，就是X基因Cre/+; Y基因Δ/+杂合小鼠，与Y基因lox/+杂合小鼠，或Y基因lox/lox纯合小鼠进行交配。如果此时，还是用常规两个引物的PCR鉴定策略，很难鉴别出非预期的生殖系基因敲除现象，必需借助设计三个引物组合的PCR鉴定策略加以确定。

三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点

      目前有四种常见Cre小鼠模型构建策略及方法，虽然每种方法都有其优势与不足，也很难说那种策略方法，能够适合或满足所有研究目的。所以，最终选择哪种方法，还是要根据研究目的具体情况决定。 

1. 质粒表达载体的转基因Cre小鼠模型：认为是Cre小鼠构建的传统方法，因为最初的Cre小鼠模型，多是应用特定启动子加Cre基因cDNA的质粒载体，通过受精卵原核注射法，获得Cre随机插入基因组的转基因小鼠。 

      由于启动子大小的限制，只选择了一定范围的表达调控元件序列，构建Cre表达载体，加上转基因随机插入基因组的位置效应影响、拷贝数的差异、以及内源基因可能破坏等因素，使每个Cre首建鼠存在个体差异，且需要通过对每个首建鼠特征进行筛选与鉴定，获得特定理想的Cre转基因小鼠模型。 因此，通过传统转基因技术构建的Cre小鼠模型，出现所谓Cre作用的“脱靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。

2. 定点敲入Cre小鼠模型：将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，借助内源性基因调控序列确定Cre表达特征，已成为传统转基因Cre小鼠构建的替代选择，也增加了Cre基因表达活性的精确性。

    应用CRISPR/Cas或赛业生物TurboKnockout的ES打靶技术方法，将单拷贝Cre定点敲入相关内源基因位点，按以下几种策略方式敲入：（1）. 特定内源基因翻译启始位点; （2）. 借助IRES序列连接，将Cre基因敲入内源基因的3’ UTR区域；（3）. 借助2A“自切割”肽连接，将Cre基因替换并敲入内源基因的终止密码处。

      一般而言，直接将Cre敲入特定内源基因的翻译启始位点的策略，往往会同时破坏了该基因的表达。有研究发现，因Cre敲入到生长发育或疾病通路等至关重要相关基因中，导致相应Cre小鼠，出现影响基因功能的潜在非特异性表型。比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，杂合Cre小鼠即出现小鼠前脑发育障碍。所以，该策略只适合于哪些杂合缺失无表型的相关基因。而应用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre特定位点敲入，可能引起的杂合缺失表型的不足。

      关于IRES与2A肽两种连接敲入策略的比较，通常认识是，传统的IRES敲入策略，几乎不会影响内源基因的功能，但也发现，由于传统经典的ES打靶过程中，Neo基因表达成分，或去除其后遗留的相关FRT序列等遗留部分序列，可能会引起内源基因3’ UTR区域结构改变，从而干扰了Cre的表达水平，使其实际表达量会相对低于内源基因本身。而新型2A肽连接敲入方式，Cre表达量与其内源基因表达几乎相似，但由于切割2A肽后，遗留的约17-21氨基酸序列，可以附着于内源基因c-端蛋白，存在潜在影响内源蛋白功能的可能性。已有研究表明，不同的2A肽序列 (P2A, T2A, E2A, F2A) 具有不同自切割效率。 尽管如此，应用敲入3'端策略，已不断赢得其吸引力。

3. BAC转基因Cre小鼠模型：将Cre基因先敲入至BAC克隆的特定基因调控元件序列后，构建BAC克隆载体，并将此BAC载体进行受精卵原核注射法，构建BAC转基因Cre小鼠模型。虽然该转基因技术也是随机整合插入，但其具有降低了质粒DNA随机插入引起的位置效应影响，避免了Cre基因5’ 端敲入可能引起的杂合缺失有表型等方面的优势。另外，相对于短启动子的表达质粒转基因而言，BAC载体包含了更多的基因表达相关的调控元件序列，因而更能反映内源基因的表达特征。但是，BAC转基因的首建鼠，仍会出现因BAC克隆载体插入位点的不同，而引起Cre表达活性不同的现象。因此，该方法并不能解决传统转基因技术的所有不足，比如，插入位点染色质结构的局部影响作用，以及潜在基因插入突变，造成Cre非真实表达等风险。而且，在BAC转基因Cre小鼠构建的同时，也可能增加了附带相应基因的拷贝数，从而干扰了相关基因功能研究的客观分析。尽管如此，相对于传统较小启动子的Cre表达载体而言，BAC转基因技术还是具有其明显的优势。

4. 安全位点敲入Cre小鼠模型：目前最新的Cre小鼠模型构建策略。为了避免基因随机插入可能导致诸多不利因素影响（比如表达位置影响作用及插入突变等），通过将Cre定点敲入到所谓的“安全” 位点，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11等位点。其中以Rosa26位点最为常用。

      Rosa26位点特点，其本身含有基因转录的广泛启动子，形成mRNA，却无翻译蛋白。所以，该基因无特定功能。借用该基因位点本身的特点与优势，有助于构建全身表达Cre基因单拷贝定点敲入小鼠模型。而Hprt和Hipp11位点则比较适合构建组织特异性敲入Cre小鼠模型。 

四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征

      前面介绍的Cre小鼠模型，其作用特异性及特征，是由引导Cre表达的基因启动子特征或构建策略方法决定的。由于许多所谓特异性基因的表达，贯穿了整个细胞/组织的胚胎发育成熟过程。而由这类基因特性启动子构建的所谓细胞/组织特异性Cre小鼠，其Cre活性作用，可能始于小鼠的胚胎时期。如果研究的靶基因又是小鼠生长发育非常重要的基因，过早实施Cre-loxP重组系统作用，有可能导致胚胎发育期靶基因的敲除，产生生殖系基因敲除小鼠的结果，也就难以实现细胞组织的特异性敲除靶基因的目的。所以，如何控制Cre表达的时间，使其成为可被诱导调控，即通过使用诱导物的方式，可以掌控Cre表达时间，结合细胞/组织特异性Cre特征，达到时空条件性靶基因敲除/表达的研究目的。

      所谓可诱导性调控CreERT系统，是将Cre基因与雌激素受体（ER）配体结合域突变体（ERT）融合一起构建而成。该ERT只与合成的ER配体结合，比如4-羟基他莫昔芬（为药物Tamoxifen的活性代谢物）。 在无该诱导剂存在下，CreERT融合蛋白与细胞浆中HSP90结合，以非活性状态存在于细胞浆，无法发挥Cre-loxP重组系统作用。当对CreERT/floxed小鼠体内提供药物诱导剂Tamoxifen (TAM），Cre蛋白与HSP90蛋白分离，进入细胞核，识别靶基因中的loxP位点，发挥Cre-loxP位点细胞/组织特异性及时间特定的重组切割作用。

      CreERT小鼠为雌激素受体配体结合域中只有一个突变位点（G521R），目前常用的CreERT2小鼠，则是在相应配体结合域中引入3个突变位点（C400V/M453A/L544A), 大大提高了其对诱导物TAM的敏感性与特异性。

      在特定时间和部位发挥诱导Cre-loxP重组切割作用能力，无疑极大提高了实验研究的灵活性。同时也增加了研究者实际应用该诱导性Cre-loxP特异性重组系统的挑战性，比如，对于该系统可能出现的包括Cre泄露表达作用，以及可能的毒性作用等，都需要研究者在实际应用中倍加谨慎小心。

五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性

      目前常用的Cre小鼠模型中，采用传统转基因策略构建的小鼠模型仍是占比最大。然而，对于转基因小鼠模型中，基因随机插入位点的相关鉴定研究占比非常少。有分析数据表明，只有不到5.2% ( 416/8012 ) 转基因小鼠模型，研究报道了基因随机插入的位点，而其中只有约2.3%（36/1631）转基因Cre小鼠品系，明确分析了其插入位点，提示分析鉴定转基因随机插入位点所面临的挑战性。 

      为什么需要鉴定分析转基因随机插入位点？第一，有利于转基因小鼠特定基因型引物的设计，便于纯合Cre小鼠的鉴定；第二，有助于条件性靶基因实验研究中，相关基因型鉴定分析策略及特异性PCR引物设计；第三，了解可能潜在的插入突变引起的非期望表型，比如随机插入导致的直接或间接的内源基因编码序列，或附近相关调控序列的破坏改变，以及引起反转/复制等的复合结构改变等。

      应用靶向位点扩增（Targeted locus amplification -TLA）技术，能有效分析鉴定随机转基因插入位点与插入基因性质特征。 有研究者应用该技术，对选择的40多种常用的转基因Cre小鼠模型，进行分析研究发现，有30种Cre小鼠模型，由于基因的随机插入，导致了相应基因组结构性变化，其中包括24种小鼠出现基因结构的缺失，6种出现结构重复。 50 % 转基因Cre小鼠内源性基因受损，且多表现为DNA大片段缺失和/或插入位点相关基因结构改变。由于随机插入导致的基因结构改变，可诱发非期望的相关表型，从而影响到Cre-loxP重组特异性靶基因实验结果的准确性。（未完，后继精彩内容请点击继续阅读）

后文链接：

技术连载之2：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

技术连载之3：Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用