干货分享！一文读懂蛋白质组TMT、4D和DIA的区别

做蛋白组学研究的朋友，在阅读文献或了解蛋白质谱检测的过程中一定看到或者听到技术人员介绍过TMT、label-free、4D蛋白质组和DIA等这样的名词或者项目。您或许还未搞清楚他们的意思，今天，小编就带大家了解这些名词或者项目的区别。

iTRAQ/TMT和Label free的区别

iTRAQ/TMT分别是由美国 Thermo 公司和 AB SCIEX公司研发的多肽体外标记定量技术，是目前运用最广泛的两种标记定量蛋白质组技术，具有相似的原理，两主要区别在于：TMT最高可同时标记16组不同的生物样品，iTRAQ最高可同时标记8组不同的生物样品。

以TMT为例，一组TMT标签试剂里的所有标签，均带有相同的质量。化学结构则由质量报告基团、质量平衡基团和肽反应基团构成，其中肽反应基团可以和肽段的N-term或末端赖氨酸侧链基团的游离氨基共价结合，从而使全部肽段标记上TMT标签。不同的TMT标签有不同质量的报告集团，通过质量平衡基团的平衡保持不同的TMT标签总分子质量相同。肽段在进入二级质谱时，质量报告基团因碎裂而被释放，在质谱低质量区产生报告离子峰，该质谱信号强度即反应了某一种肽段在不同样本中的相对表达量。

TMT标签化学结构图

因此使用同位素可以对不同样品进行标记，然后将同一批样品一起上机进行检测，根据不同的同位素标记来区分各个样品中不同蛋白的表达量。这种技术方法的优势是：定量准确，数据重现性好，灵敏度高对样品要求量低，检测蛋白数量多。缺点是由于同位素标记最多只有16种，样品量大的时候需要在每次上机时加内参样品，增加了成本。另外，无法剔除离群样本进行重新分析，这也是TMT蛋白质谱应用的限制。

相对于TMT对蛋白的标记定量，Label free无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，每个样品单独上机，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。Label free的优势是无需依赖同位素标记，每例单独检测，因此实验设计灵活，适合临床大几十例、上百例样本的检测，同时也能看到样本中的 “有还是无”的蛋白。缺点是对仪器的稳定性、实验人员的操作等可能产生系统误差的因素要求极高。

4D蛋白质组

4D蛋白质组技术是新一代蛋白质组学分析技术，由布鲁克公司与蛋白质组学领域的领军人物Matthias Mann、Ruedi Aebersold，Ben Collins和Hannes Roest等科研团队合作推出的技术。基于布鲁克的TimsTOF Pro，基于双Tims和PASEF的数据采集模式，具有更高的采集速度、灵敏度和特异性，引领临床蛋白质组学在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期等性能上全面提升。详情请查看链接：https://mp.weixin.qq.com/s/CxmUhYrlZ_tTc_ZrJc2tnA

4D蛋白质组学

DIA和DDA

了解DIA和DDA之前，我们先要简要了解下当前基于LC-MS/MS蛋白质谱的基本流程：准备样本——抽提和纯化蛋白质——胰酶消化成肽段——液相色谱分离（LC）——一级质谱检测（母离子信号）——肽段破碎进入二级质谱检测（用于确定氨基酸序列）——数据分析。

DIA和DDA指的就是两种进行二级质谱的数据采集模式。DDA是一种选择性数据采集方式，而DIA是数据全扫描采集方式。

两者的区别比较如下表所示

因此，相对于传统的是DDA，DIA具有如下技术优势：

（1）全景式扫描，数据无遗漏，蛋白质覆盖率、定量准确性高
（2）样本无需分馏分上机，极大缩短了每个样品的检测周期；不受样本量限制，可用于大规模样本数量检测
（3）相比于DDA模式，DIA缺失值更少，鉴定与定量结果的可重复性更高，数据可回溯

基于新一代的赛默飞Exploris 480和布鲁克timsTOF Pro，吉凯基因开发了DIA 2.0产品，相比常规DIA常规路线，性能有极大提升，主要优势如下：

▪ 更高检测灵敏度，挑战质谱分析极限
▪ 更高检测深度和覆盖度，提高50%+鉴定量
▪ 定量重复性、完整性、可靠性全面提升

总结

• TMT蛋白质组是指使用TMT标签对样本蛋白进行标记并混样上机的一种蛋白质谱检测方法，一次性最多能实现对16个样本的检测。而相对于标记，Label free则是一种不进行蛋白标记、逐一对样本进行蛋白质谱的方法，也是目前使用更广泛的一种方法。
• 4D蛋白质组则是指相对于传统质谱仪对肽段保留时间、质荷比（m/z）和质谱强度的三维蛋白检测，增加了离子淌度的（ion mobility）的四维蛋白检测，是质谱仪器性能的提升。4D蛋白质谱仪有更高的分辨率。吉凯基因的4D蛋白质组学使用的是德国布鲁克公司的4D质谱仪——Timstof Pro。
• DIA：Data Independent Acquisition即数据非依赖的采集，是相较于数据依赖采集（DDA，Data Dependent Acquisition）的一种数据采集模式。相较于DDA，DIA是一种更全面的数据采集模式，适用于大样本量的研究。而DIA采集模式下， 倾向于采集高丰度蛋白信息，因此其缺失值更多，不适合进行大样本规模的蛋白质谱研究。

吉凯基因根据研究者的不同需求，提供差异化的蛋白组学技术服务，主推产品总结如下，欢迎前来咨询。

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吉凯基因凭借多年在靶标筛选及验证服务领域的技术积累，建立的标准化 、工程化 、系统化的GRP平台，为中国研究型医生提供科研服务，加快科研成果转化。其中，蛋白质组学平台拥有多台timsTOF Pro、Exploris 480高精度质谱仪，专业领先的Spectronaut Plusar、Mascot等分析软件，提供专业的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修饰组等检测服务，强大的机器学习算法、IPA分析、蛋白基因组分析服务，系统的生物标志物、分子分型、药物靶点、基因功能研究等解决方案，真正让广大研究型医生的科研工作更省心、更省力、更高效。