定量测定生理条件下染色质相关蛋白相分离特性的新方法

　　

细胞核主要由DNA、RNA和蛋白质等成分组成，是基因存储、复制与调控的中心。在细胞核内，蛋白质等生物大分子通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）形成生物分子凝聚体，已经被报道与基因表达1、染色质高级结构2等紧密相关。然而，目前鉴定与评估蛋白相分离特性主要依赖于体内外凝聚体形态、光漂白恢复实验等定性或低通量方法，如何系统性地、定量测定生理条件下染色质相关蛋白相分离特性，是领域内亟待解决的问题。

近日，清华大学医学院/北京信息国家研究中心张奇伟研究组师明磊与北京大学基础医学院李婷婷研究组，以及中国医学科学院基础医学研究所陈阳合作在Genome Biology杂志上在线发表文章“Quantifying the phase separation property of chromatin-associated proteins under physiological conditions using an anti-1,6-hexanediol index”，开发了能定量描述生理状态下染色质相关蛋白相分离特性的新方法。

在该工作中，作者基于此前开发的染色质构象捕获技术BL-Hi-C 3，开发出富集染色质相关蛋白的新方法Hi-MS。预实验表明Hi-MS在使用较低的细胞量（107）时，也具有较好的灵敏性和特异性。

1,6-己二醇（1,6-Hexanediol，1,6-HD）具有适度的疏水相互作用干扰能力，能在不破坏生物膜结构的基础上使相分离凝聚体发生解聚，并使相关蛋白从染色质脱离，因而被广泛应用于鉴定蛋白相分离特性。作者利用1,6-HD处理前后蛋白质与染色质结合水平的变化，定义了染色质相关蛋白的抗1,6-HD指数AICAP（Anti-1,6-HD Index of Chromatin Associated Proteins）。

AICAP代表了不同蛋白对1,6-HD处理的敏感性，例如FUS、MED1等蛋白脱离较多，具有较低的AICAP，而组蛋白、SMC-3等结构性蛋白脱离较少，具有较高的AICAP。

为了进一步说明AICAP的生物学意义，作者利用生物信息学分析，发现AICAP与蛋白的相分离特性相关（图3）。AICAP较低的蛋白，拥有较高比例的内在无序区域（intrinsic disordered regions, IDR）和低复杂度区域（low complexity domains, LCD），其无序区域内具有较多的疏水氨基酸。AICAP与常用的LLPS预测工具预测结果吻合，较低AICAP的蛋白具有较高的相分离可能性。并且，已知的亚细胞核结构（nuclear body）组分蛋白具有较低的AICAP。作者还使用了16,-HD的类似物2,5-己二醇（2,5-Hexanediol, 2,5-HD）进行了对照实验，发现2,5-HD AICAP与LLPS无上述相关性，进一步证明了1,6-HD AICAP与LLPS关系的特异性。通过选取不同AICAP值的7个蛋白，作者进行了细胞内荧光漂白恢复实验，结果表明流动性较好的蛋白具有较低的AICAP。

近年来，许多研究表明LLPS可能是染色质高级结构的形成机制之一，作者为了探究1,6-HD溶解相分离凝聚体对染色三维结构的影响，在1,6-HD处理前后进行了BL-Hi-C实验。整体而言，与异染色质等区域相比，转录活跃区域的染色质相互作用对1,6-HD的处理更加敏感。这与参与活跃转录的蛋白质拥有较低的AICAP相吻合。在染色质区室（compartment）层面上，作者观察到，A compartment代表的活跃区域变化较大，而B compartment代表的抑制区域则相对稳定。在拓扑相关结构域（topologically associated domain, TAD）层面上，结构性蛋白CTCF、SMC3富集的TAD边界较稳定；位于A compartment，缺少足够CTCF、SMC3结合的TAD边界则受影响较大，表现为边界两侧的inter-TAD相互作用显著增加，导致部分TAD边界消失（15.6%）。染色质环（loop）是更精细尺度的染色质相互作用，1,6-HD的处理使大部分（61.5%）的loop减弱甚至消失，尤其是正处于活跃运动阶段的DNA loop。总体而言，TAD和loop层面的变化与compartment层面的变化一致，并进一步与其相关蛋白AICAP相一致，即转录活跃区域的蛋白结合以及染色质高级结构均对1，6-HD处理更敏感。

系统性鉴定、描述生物大分子凝聚体及其组分的实验方法开发，对于相分离领域的发展十分重要。本篇研究中，作者新开发Hi-MS技术，结合Hi-C全方位描述了蛋白质水平和基因组水平在相分离凝聚体被1,6-HD溶解后的变化情况。AICAP能定量反映不同蛋白质在生理状态下对相分离凝聚体破坏的敏感程度，是对荧光漂白恢复和体外重建等现有实验手段的有效补充。

清华大学医学院师明磊助理研究员是本论文的共同第一作者和共同通讯作者，北京大学基础医学院八年制博士生游铠强为本论文共同第一作者，李婷婷副教授、张奇伟教授、陈阳研究员为共同通讯作者。清华大学医学院沈晓骅教授、李丕龙教授为本论文提供了FRAP实验所需的荧光蛋白融合表达质粒，清华大学医学院李海涛教授和生命科学院颉伟教授为本论文提出了宝贵建议。这项工作由国家重点研发计划《蛋白质机器动态网络的临界理论和方法研究》 (2017YFA0505503)，国家自然科学基金原创探索计划《生物分子机器的智能设计与控制》 (62050152)等项目提供经费支持。

 

参考文献：

1. Sabari, B. R. et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science 361, eaar3958 (2018).

        2. Ahn, J. H. et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature (2021) doi:10.1038/s41586-021-03662-5.

        3. Liang, Z. et al. BL-Hi-C is an efficient and sensitive approach for capturing structural and regulatory chromatin interactions. Nat Commun 8, 1622 (2017).