第二部分:mRNA疫苗的设计、传递和制造

mRNA疫苗的抗原设计

到目前为止，mRNA的体外转录技术已经成熟，最常用的方法是利用T3、T7或sp6 RNA聚合酶和线性DNA(线性化质粒DNA或PCR合成DNA)合成mRNA。

在真核细胞中，成熟mRNA的一些基本结构元件是维持mRNA功能所必需的，包括5 ' 帽子 (5 ' cap)、5 ' untranslate region (5 ' UTR)、open reading frame (ORF) region、3 ' untranslate region (3 ' UTR)和poly(A) 尾结构。保持mRNA结构的完整有利于mRNA的稳定性和表达能力。根据其完整的结构对mRNA序列进行修饰，可以进一步优化mRNA疫苗的效率(图1)。

Overview of the development of mRNA vaccines: Part Two.

图1 mRNA疫苗设计示意图

mRNA分子在体外合成，具有帽状结构(m7GpppNm)。尿苷被伪尿苷取代。人类使用优选密码子优化UTR和polyA尾部序列。这些修饰提高了RNA的稳定性和翻译效率，降低了免疫原性。

信使RNA疫苗的递送

有效的体内递送对预防mRNA疫苗至关重要。为了转化为免疫原性蛋白，外源mRNA必须穿过宿主细胞膜的屏障，进入细胞质。由于mRNA疫苗的不稳定性，mRNA疫苗的引入需要一些载体的协助。因此，科学家们开发了脂基传递、聚合物传递、肽传递、病毒样复制子粒子传递和阳离子纳米乳传递(图2、图3、表1)。此外，裸mRNA疫苗也可以直接注射到细胞中。到目前为止，新开发的DC-based mRNA疫苗已被用于诱导适应性免疫。

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图2 mRNA疫苗的主要递送方式

图3 mRNA疫苗的主要递送方式

图中显示了mRNA疫苗的常用传递方式以及典型的载体分子和粒子复合物的直径:裸mRNA (a部分);活体电穿孔裸mRNA (b部分);鱼精蛋白(阳离子肽)复合物mRNA (c部分);带正电水包油阳离子纳米乳相关的mRNA (d部分);mRNA与化学修饰的树枝状大分子相关，并与聚乙二醇(PEG)脂质复合物(e部分);聚乙二醇脂质纳米颗粒中的鱼精蛋白复合物mRNA (f部分);与阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺(PEI))相关的mRNA (g部分);与定性成分相关的阳离子聚合物如PEI和脂质MRNA (h部分);与多糖(如壳聚糖)颗粒或凝胶相关的mRNA(i部分);阳离子脂质纳米粒(如1,2-二油酰氧基)-3-三甲基丙烷胺(DOTAP)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)脂类)中的mRNA(j部分);与阳离子脂质和胆固醇复合物的mRNA (k部分);阳离子脂类、胆固醇MRNA与PEG-脂类复合物(l部分)。

表1 mRNA的传递系统
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LNP是应用最广泛的平台，已被证实在mRNA传递中具有最好的临床效果。LNP主要由可电离的脂类、胆固醇、磷脂和聚乙二醇-脂类组成(图4)。

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图4 mRNA脂质纳米复合物示意图

LNP最初被设计用于siRNA的传递，现在被用于mRNA的传递，是临床上最可译的非病毒传递载体。LNP主要由可电离的氨基脂分子、辅助磷脂、胆固醇和脂锚聚乙二醇(PEG)组成。可电离脂类是一种两亲结构，具有亲水性头基(包含一个或多个可电离胺)，可以促进自组装的碳氢链，以及头基和碳氢链之间的连接物。可电离的脂类是设计来获得正电荷的质子自由胺在低pH值。它们主要有两个用途:(1)在LNP的制备过程中，带正电荷的脂质通过静电相互作用促进负电荷。荷电mRNA的包封;(2) LNP在细胞内运输后的酸性核内体微环境中，带正电的脂质与离子核内体膜相互作用，促进膜融合和失稳，导致LNP和核内体释放mRNA。

在生理pH下，可电离的脂质保持中性，提高稳定性和减少全身毒性。具有代表性的可离子化脂类有:主动设计的Dlin-DMA、Dlin-KC2-DMA和Dlin-MC3-DMA;C12-200和cKK-E12是基于高水平的组合库通量筛选的;下一代COVID-19脂质，包括DLN-MC3-DMA衍生物L319，C12-200和CKK-E12衍生物，COVID-19疫苗脂质ALC-0315和SM-102，TT3和生物可降解衍生物FTT5，维生素衍生脂质SSPALME和VCLNP，A9，L5，A18脂质，ATX脂质和LP01，它们大多是可生物降解的。除了可电离的脂质外，磷脂(DOPE和DSPC)和胆固醇的加入可以提高脂质双分子层的稳定性，协助膜融合和内体逃逸。脂锚定PEG可降低巨噬细胞介导的清除。更重要的是，脂锚聚乙二醇有助于防止粒子聚集，提高存储稳定性。

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图5临床前研究和临床试验中具有代表性的LNP结构和可离子化脂质

mRNA疫苗的生产

一旦确定病原体或宣布疫情以后，将通过联合测序、生物信息学和计算方法(如果还没有)确定病原体和抗原的基因组。通过电子存储候选疫苗抗原序列，可用于全球范围内mRNA疫苗的计算机设计，然后通过分子克隆或合成构建质粒DNA模板。该中试疫苗批次是在无细胞系统中通过体外转录和capping mRNA，使用传递系统纯化和配方生产的。进行过程分析和有效性测试，以评估实验mRNA疫苗批次的质量。如有必要，可在免疫原性和/或疾病动物模型中进一步检测实验性mRNA疫苗批次。最后的mRNA疫苗是通过一个共同的过程扩增和制造的，只需要很少的修改，并且可以快速测试和分发使用(图6)。

图6 mRNA疫苗生产示意图

与传统疫苗相比，mRNA最重要的优点之一是制造相对简单。为了生产具有特定质量属性的信使RNA产品，必须执行一系列的制造步骤。目前还缺乏一个完整的多步骤结合的制造平台。这些可以分为上游加工(包括mRNA的酶生产)和下游加工(包括纯化mRNA产品所需的单元操作)(图7)。

图7 mRNA疫苗生产过程的生产和纯化步骤示意图

mRNA的产生可以通过使用capping类似物的一步酶反应进行，也可以通过使用牛痘capping酶的两步反应进行。实验室规模的mRNA纯化过程包括DNase I酶切，然后LiCl沉淀。采用成熟的色谱策略，结合切向流动过滤，可获得更大规模的纯化;新的色谱方法也可用来补充标准纯化。

必须改进现有的IVT mRNA生产方法，使其商业化，支持市场需求。由于工艺产量和生产规模对制造成本和各代理成本产生影响，推测连续加工将具有降低成本的特殊优势。连续加工已经用于化学和制药行业，以运行灵活和成本效益高的过程，并最终提供按需生产。此外，通过连续制造的过程集成也可以缩短操作时间，促进自动化和过程分析技术(PAT)，从而提高生产率和产品质量。信使RNA制造的相对简单使得这个过程非常适合连续加工，特别是在微流控尺度(图8)。

图8 mRNA疫苗连续生产过程的概念设计

该过程包括一个连续的两步酶反应，随后是切向流动过滤策略和两个多模式色谱步骤的酶循环，一个是结合洗脱模式的中间纯化，另一个是流动模式的纯化，并采用第三切向流过滤模块实现配方。