CRISPR基因编辑技术为肥厚型心肌病带来新的见解

肥厚型心肌病（HCM）是所有遗传性心脏病中最常见的，是心脏性猝死的主要原因。它的特征是心肌异常增厚，随着时间的推移可能导致心脏功能不全，最终导致心力衰竭。

　　

一篇论文发表在《美国国家科学院学报》(PNAS)和由贝思普瑞特,加州大学圣芭芭拉分校机械工程教授和主任校园生物工程研究所,描述一个复杂的长期协作的结果,包括斯坦福大学研究人员华盛顿大学和肯塔基大学。这项研究使人们对基因突变如何在细胞水平上导致HCM有了新的理解，并对如何预防HCM有了新的看法。

在他们的论文中，作者解释说，已经确定了超过1000种导致HCM的基因突变。它们中的大多数存在于编码肌体蛋白的基因中。肌体蛋白是心肌的结构组成部分，负责产生和调节收缩和松弛。大约三分之一的突变位于-心肌肌凝蛋白，这是驱动心脏细胞收缩的主要蛋白质。心肌和我们身体里的其他肌肉的收缩，是由于运动蛋白肌凝蛋白沿着肌动蛋白分子链“行走”的过程，这个过程被称为跨桥循环。在这个过程中，以ATP形式存在的化学能转化为机械能，最终导致心脏收缩。

在收缩之前，缠绕在一起的两股肌凝蛋白分子中的一股的头部折叠在肌动蛋白分子上。当被称为生物系统“能量货币”的ATP分子与肌凝蛋白头部结合时，肌肉收缩就开始了。肌凝蛋白头部和附着的ATP，然后从肌动蛋白上分离，启动ATP的水解，转化为ADP和一个磷酸基。这个过程释放能量，使肌凝蛋白进入高能量状态，并改变肌凝蛋白的形状，以便它可以沿着肌动蛋白爬行。在这一点上，磷酸从肌凝蛋白中释放出来，导致肌凝蛋白推动肌动蛋白并释放磷酸，这导致肌凝蛋白走到肌动蛋白的下一条链并收缩肌肉。所有这一切，包括数以百万计的肌凝蛋白以微秒的速度穿过肌动蛋白，必须以适当的速度发生，以保持心脏健康。

由于HCM经常在-心肌肌凝蛋白突变的患者中观察到，因此曾经假设HCM突变导致一系列事件，最终表现为对心脏本身的损害。这项研究对这一想法进行了测试，重点是一个单一的突变P710R，与导致运动速度增加的其他MYH7突变相比，它显著降低了体外运动速度——肌凝蛋白在肌动蛋白上行走的速度。

该项目的首要研究问题是了解与心脏病有关的突变如何在细胞水平上改变心脏功能。

该研究小组利用CRISPR技术，通过插入P710R突变，编辑了人类诱导的多能干细胞心肌细胞(负责心脏收缩的细胞)。普鲁伊特领导着UCSB的干细胞库，在这里，没有遗传异常的“干净”细胞系被维护和复制，供大学研究人员使用。这种干净、无突变的细胞系为与细胞进行比较提供了一个完美的基准，可以非常精确地看到P710R突变的影响。例如，研究小组正在测试在相同的遗传背景下与心脏病相关的不同突变的影响。

“你可以让10个人在这种蛋白质中有相同的基因突变，他们可能有不同程度的临床意义，因为他们基因组的其余部分是不同的;这就是我们的独特之处。”普鲁伊特说。“这些线条让我们检查基因突变的结果。通过比较不同突变的影响，我们可以开始梳理这些变化是如何导致HCM的。它使我们能够仔细观察细胞如何以及为什么会以这种方式适应突变，并获得数据，并将其与心脏壁厚度和所有其他下游发生的事情联系起来。”

这项研究开始于大约15年前，当时普鲁伊特还在斯坦福大学，并促成了这篇合作论文。现在，CRISPR技术使研究人员能够设计表达与心脏病相关的特定突变的细胞，然后评估分子和功能变化，以确定在HCM患者中发现的个体突变对细胞的影响。这些研究将提供在分子水平上个体突变如何转化为患者HCM的机制理解。

在这个项目中，一旦引入突变，普鲁伊特实验室(UCSB)和伯恩斯坦实验室(斯坦福大学)合作，使用牵引力显微镜对细胞进行检测，这种检测方法可以同时观察跳动细胞及其产生的力。Spudich实验室(斯坦福大学),领导独立研究相同的突变蛋白质在分子水平上使用光学陷阱,中光压力应用于控制精确的位置和力量之间的肌动蛋白“哑铃”珠子作为肌动蛋白肌球蛋白头沿着,测量肌凝蛋白的权力周期。实验表明，P710R突变减少了肌凝蛋白运动的步长(即每一步的长度)和肌凝蛋白从肌动蛋白分离的速率。

在与肯塔基大学研究人员Kenneth Campbell的合作中，这些观察结果与肌凝蛋白马达如何在细胞中相互作用产生力量的计算模型进行了比较。结果证实了肌凝蛋白“超松弛状态”调控的关键作用。正如普鲁伊特解释的那样，“肌凝蛋白的头部在很多时候处于超放松状态，指的是当它与肌动蛋白分离时。任何改变肌凝蛋白马达与肌动蛋白结合时间或强度的突变或药物都将改变细胞力的产生，并改变驱动重塑、生长或肥厚的下游信号事件。”

本研究发现P710R突变使超弛豫状态不稳定。结果，更多的肌凝蛋白头与突变细胞中的肌动蛋白结合，这解释了在这些细胞中观察到的力量增加。

对于普鲁伊特来说，除了重要的科学发现之外，这项工作的一个重要收获是持续合作的价值。她说:“这篇论文涵盖的尺度通常不是任何一个实验室甚至任何两个实验室的研究主题。”“这就是为什么这篇论文有这么多作者，包括几名学生和和我一起工作的博士后，詹姆斯·斯普迪奇和丹尼尔·伯恩斯坦。

“这在科学上意义重大，但也令人满意，因为这种程度的整合使在多个尺度上测试这一想法成为可能。跨越这些实验室和这些技能在如此广泛、多学科的合作中工作是很有趣的，看到分子测量和计算的力量，以及细胞衍生的测量，使我们能够进行基因工程和解剖一个单一的突变，”普鲁伊特说。“直接测试一个特定的突变是如何导致HCM的变化的，这真的是惊人的。”

作为这次合作的结果，Pruitt补充说，“我们可以了解细胞水平上发生了什么。然后我们可以开始开发模型并确定下一代药物疗法。除了识别症状，我们还可以研究功能障碍背后的机制，然后在它变成一种疾病之前在细胞水平上解决这些问题。”

Journal Reference:

1. Alison Schroer Vander Roest, Chao Liu, Makenna M. Morck, Kristina Bezold Kooiker, Gwanghyun Jung, Dan Song, Aminah Dawood, Arnav Jhingran, Gaspard Pardon, Sara Ranjbarvaziri, Giovanni Fajardo, Mingming Zhao, Kenneth S. Campbell, Beth L. Pruitt, James A. Spudich, Kathleen M. Ruppel, Daniel Bernstein. Hypertrophic cardiomyopathy β-cardiac myosin mutation (P710R) leads to hypercontractility by disrupting super relaxed state. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2021; 118 (24): e2025030118 DOI: 10.1073/pnas.2025030118