科学家通过化学修饰的RNA CRISPR促进人类细胞中的基因敲除

在最新的一项正在进行的扩展基因及其表达修饰技术的努力中，研究人员开发了化学修饰的导向RNA，用于靶向RNA而非DNA的CRISPR系统。这些化学修饰的导向RNA显著增强了人类细胞中靶向——追踪、编辑和/或敲除——RNA的能力。

　　

在今天发表在《细胞化学生物学》(Cell Chemical Biology)杂志上的一项研究中，该团队探索了一系列不同的RNA修饰，并详细说明了修饰引导基因如何将CRISPR活性的效率从未修饰引导基因的2倍提高到5倍。他们还表明，优化的化学修饰将CRISPR靶向活性从48小时延长到4天。研究人员与Synthego公司和新英格兰生物实验室的科学家合作，汇集了一个具有酶纯化和RNA化学专业知识的多样化团队。为了应用这些优化的化学修饰，研究小组瞄准了来自健康捐赠者的人类T细胞的细胞表面受体，以及负责COVID-19大流行的RNA病毒SARS-COV-2所有已知变异所共享的基因序列的“通用”片段。

提高CRISPR-Cas13指南的效率和“寿命”对研究人员和药物开发人员具有重要价值，可以更好地进行基因敲除，并有更多时间研究该基因如何在相关途径中影响其他基因。

“CRISPR RNA引导物的传递具有挑战性，由于引导物的快速降解，抑制时间有限。该实验室的博士后科学家、该研究的第一作者之一亚历杭德罗Méndez-Mancilla博士说:“我们受到为其他dna靶向CRISPRs开发的指南修改的启发，想测试化学修饰的指南是否可以提高人类细胞中针对CRISPR-Cas13的rna靶向的敲灭时间。”

该实验室之前的研究概述了最佳Cas13指导设计的原则，并于2020年3月发表在《自然生物技术》杂志上，研究人员借鉴了该研究，系统地应用和测试了各种化学修饰。例如，他们发现添加3个不同化学键的碱基将它们相互连接(硫代磷酸修饰)，将人类细胞系中的RNA靶向敲除能力延长了几天。在原代T细胞中，硫代磷酸修饰导致CD46(一种参与免疫系统调节的受体)表达下调60 - 65%，相比之下，使用未修饰引导的CD46表达下调40 - 45%。

该团队还发现，某些甲基化和反向终止子修饰也提高了Cas13的活性。对于所有的修饰，这些修饰的RNA碱基的位置也是至关重要的。当放置错误时，修饰会导致引导rna不起作用。该实验室的博士后科学家Hans-Hermann Wessels博士是这项研究的第一作者之一，他说:“我们希望这些改进的CRISPR Cas13指南的有效性和稳定性将有助于为在原代细胞中使用rna靶向CRISPRs铺平道路。”

“这些修改过的指南进一步扩展了基因组和转录组工程的工具箱。人类基因组的非编码元素,针对DNA可能不是有效的,和其他生物,如RNA病毒如冠状病毒或流感,不能有针对性的,”娜博士说,核心教员、NYGC生物学助理教授,纽约大学,神经学和生理学助理教授,纽约大学格罗斯曼医学院该研究的资深作者。

例如，该团队在人类细胞中敲除RNA病毒SARS-CoV-2的通用前导序列片段的测试，只有使用Cas13这样的RNA靶向CRISPR才能实现。SARS-CoV-2进入细胞并释放其RNA基因组，然后转录成更小的RNA，称为亚基因组RNA。这些亚基因组rna负责制造病毒复制并感染其他细胞所需的不同蛋白质。在每个亚基因组RNA的开始处发现了通用先导序列。因此，一种针对通用前导序列的有效方法可能会保护细胞免受病毒的进一步复制和感染。

同样重要的是，CRISPR-Cas13能够在不永久改变潜在DNA基因组序列的情况下调节基因表达，这与Cas9或Cas12a等DNA靶向CRISPRs一样。瞬态调制刺激基因表达结果通常是生物医学研究和药物开发的首选。例如，SARS-CoV-2的信使RNA疫苗会短暂表达，但会产生一种免疫记忆，这种记忆会持续到它们的表达寿命之后。

细胞化学生物学研究的共同作者包括实验室博士后科学家Mateusz Legut博士;Anastasia Kadina，博士，高级科学家，化学研究，Synthego公司;Megumu Mabuchi，副科学家，RNA生物学和基因组编辑，新英格兰生物实验室;John Walker博士，Synthego Corporation化学研究部主任;G. Brett Robb博士，RNA和基因组编辑科学总监，Kevin Holden博士，Synthego公司科学总监。

Journal Reference:

1. Alejandro Méndez-Mancilla, Hans-Hermann Wessels, Mateusz Legut, Anastasia Kadina, Megumu Mabuchi, John Walker, G. Brett Robb, Kevin Holden, Neville E. Sanjana. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas13 knockdown in human cells. Cell Chemical Biology, 2021; DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.07.011