肿瘤单细胞转录异质性研究，认领专属您的RNA FISH探针

肿瘤异质性是人类癌症的普遍特性，从临床的角度来看，任何类型的分子生物标志物的肿瘤内异质性都是一个重大挑战。因为表达突变或感兴趣的生物标志物的肿瘤细胞的比例以及它们在肿瘤中的位点分布可能会影响治疗反应。此外，不同亚克隆的空间组织结构——不仅仅是它们的数量——可能会影响临床结果。
 
在下面这篇文章中，Laura Annaratone等人对49个档案乳腺癌标本，在转录水平对两个临床最相关的乳腺癌生物标志物和药物靶点：表皮生长因子受体2 (HER2) 和雌激素受体1 (ER)在肿瘤内的形貌特征，进行了空间分析。

实验人员开发了一种在FFPE乳腺癌组织切片中做单分子RNA FISH 的 protocol (FFPE-smFISH), 能够在单个细胞和多个肿瘤区域同时检测和绝对定量HER2 和ER成熟转录本。他们并以标准的诊断技术为基准，证明了FFPE-smFISH方法能够将乳腺癌正确地分类到确认的分子亚群。通过对数千个单细胞中的转录本进行计数，他们发现和鉴定了不同的表达模式和细胞间变异水平。比如在HER2和ER都表达的样本中，许多细胞共表达这两个基因，但表达水平通常不相关。最后，他们应用生态学领域的多样性指标来评估HER2和ER基因表达在肿瘤内的分布，揭示了这些关键生物标志物的空间分布即使在相同亚型的乳腺癌中也有很大的差异。

此研究结果表明，FFPE-smFISH是一种通用的、易于实现的、可靠的方法，它可以在诊断中获得大量的应用，也是一种强有力的定量分析临床样本中选定的生物标志物在肿瘤内的转录异质性的方法。并为评估肿瘤内转录异质性的临床影响的研究铺平了道路。

文章中，smFISH（单分子FISH）探针设计图如下：

Figure 1（A）: A. Scheme of smFISH. A pool of usually 30-50 oligos, each of 20 nucleotides (nt) length and labeled with a single fluorophore (red), is hybridized in situ to a complementary target RNA (gray line). As a rule of thumb, a transcript that can be targeted with at least 20 oligos can be detected by smFISH.

乳腺癌FFPE组织切片中，HER2 (蓝绿色)和ER (红色) mRNA 的检测结果：

Figure 1（B，C，D）:   B. Example of HER2 (cyan) and ER (red) mRNA detection in a FFPE breast cancer tissue section. Each spot corresponds to a diffraction-limited fluorescent signal that is generated upon binding of the fluorescently labeled oligos forming the smFISH probe to their target. Gray, DAPI-stained nuclei. The white dashed lines mark the boundary between tumor and stroma. Tumor regions are typically characterized by a high density of large nuclei with peripheral chromatin, whereas the nuclear density is much lower in stromal areas. (C-D) Magnifcation of the region encircled by the white square in B. C. HER2 transcripts (cyan dots). D.ER transcripts (red dots). The yellow circles mark individual mRNA molecules automatically identifed by our custom software.

基因表达研究中，单个细胞的特征常常有别于该群体的平均特征，也能反映细胞内真实的情况，揭示qPCR忽略掉的细胞间异质性的问题。这样的细胞异质性已经成为相关研究中不可忽视的现象。因此，近年来能够实现单分子水平RNA原位检测的FISH（smFISH）技术备受青睐。它们能够直观的实现单个细胞中RNA的定量和亚细胞水平的定位。在诸多可选技术中，Stellaris技术尤为突出！

Stellaris RNA FISH----完整细胞或组织中的单个RNA分子同时进行检测、定位和定量的一项技术。

Stellaris™ RNA FISH是基因有限公司代理的LGC Biosearch公司明星产品，能够实现亚细胞定位和定量RNA，观察RNA组织特异性表达，研究单细胞之间RNA表达的异质性。同时非常适合于多重RNA共定位，以及RNA-蛋白共定位。即单分子水平的RNA原位、多重、定量。

Stellaris™ RNA FISH工作原理
     
多条相同荧光标记的探针结合到一条RNA靶标上产生一个显微镜下肉眼可见的荧光点。

操作简单，仅需一步杂交，一天内即可完成smFISH检测。

LGC Biosearch Technologies 提供免费的在线探针设计软件，针对目标RNA 设计最佳的Stellaris RNA FISH 探针组。同时，针对常见基因，有提供DesignReady探针组，其经过专业的设计以及严格的生物信息学分析以确保其特异性。这些DesignReady探针包含众多生物模型的癌症特异性的靶标。

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Stellaris™ RNA FISH出版信息：

作为设计、开发和生产荧光引物/探针和相关分子诊断试剂的全球领导者，Biosearch的Stellaris RNA FISH技术近年来已得到了越来越多的科研工作者认可，引用的paper超过33%发表于Nature、Science、Cell及其子刊上！

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