复旦大学团队Biomaterials发文，另辟蹊径治疗肩袖损伤

复旦大学附属华山医院运动医学科陈世益教授领导的研究团队近日在生物材料领域顶尖期刊《Biomaterials》上发表文章，证明了一种间充质干细胞的条件培养基在促进腱-骨愈合上具有积极作用。

　　

复旦大学附属华山医院运动医学科陈世益教授领导的研究团队近日在生物材料领域顶尖期刊《Biomaterials》（IF=10.317）上发表文章，证明了一种间充质干细胞的条件培养基在促进腱-骨愈合上具有积极作用。

肩袖撕裂是一种常见的运动损伤，威胁着专业运动员及广大运动爱好者的健康。医生大多采用肩袖修复术将撕裂的肌腱重新固定在骨表面。大多数患者能够获得良好的效果，但有些患者会发生再次撕裂。出现这种现象的原因是止点（enthesis）无法快速再生腱-骨界面的结构。止点是肌腱或韧带附着于骨头的部位。

基于再生医学的干细胞治疗有望为肩袖损伤提供新的治疗手段。人们已采用不同来源的间充质干细胞（MSC）来促进腱-骨愈合，并在实验中获得了成功。然而，引入外源性材料也存在风险。植入的干细胞可能具有致瘤性，这限制了临床应用。近期研究发现，真正有效的是干细胞的分泌组（secretome），而间充质干细胞的条件培养基包含了干细胞分泌的所有营养因子。

基于此，研究人员收集了人类骨髓来源干细胞的条件培养基（hBMSC-CM），并检测了这种无细胞方法是否能够在大鼠肩袖修复模型中促进腱-骨愈合。为了确保培养基在腱-骨界面处局部释放，他们将小块的海绵浸泡在培养基中，然后植入肩袖修复处。之后，他们利用相关细胞系在体外验证了观察到的结果，并在体内进一步研究了hBMSC-CM介导的腱-骨愈合作用（图1）。

图1. 这项研究的路线图

hBMSC-CM促进了大鼠肩袖处的腱-骨愈合

研究人员首先利用赛业生物的间充质干细胞分化培养基，对间充质细胞进行了鉴定。他们接着收集了间充质干细胞的条件培养基，测定了几种生长因子的浓度。他们发现，培养基中含有TGF-β、VEGF和IGF-1等能够促进腱-骨愈合的生长因子。

之后，他们将海绵切成1 mg的小块，在灭菌后放入hBMSC-CM中浸泡30分钟，并植入大鼠的肩袖修复处。术后4周和8周，他们通过组织学和放射学方法观察到了再生的止点（图2）。Micro-CT显示，CM组修复区域的骨密度显著高于DMEM对照组。

由于成纤维细胞是腱-骨止点重建的主要参与者，他们还检测了腱-骨界面处的α-SMA连续表达。根据免疫组化染色分析，两组患者主要在术后2周表达α-SMA。定量分析结果表明，CM组的阳性面积显著高于DMEM组，表明CM组的重建过程更为活跃。这些结果显示，hBMSC-CM可提高再生止点的质量，促进腱-骨愈合。

图2. 肩袖修复后再生止点的组织学和放射学分析

hBMSC-CM的积极作用与巨噬细胞有关

体内实验表明，海绵的完全降解期约为2周，与炎症期重叠。在炎症发生期间，巨噬细胞浸润在腱-骨界面。于是，研究人员分析了hBMSC-CM是否在体内和体外影响巨噬细胞的表型。免疫组化结果显示，术后2周，CM组的CD86（M1表型标志物）水平显著低于DMEM组，而CD163（M2表型标志物）水平显著高于DMEM组，表明hBMSC-CM能够抑制M1表型并促进M2表型（图3）。

与表型变化一致，促炎细胞因子（TNF-α、IL-1α和 IL-1β）和抗炎细胞因子（TGF-β、IL-10和IL-13）的浓度也发生了变化。在LPS刺激后，促炎细胞因子的mRNA和蛋白质水平显著升高，而抗炎细胞因子的mRNA水平没有显著变化。不过，hBMSC-CM的干预下调了促炎细胞因子的水平，而增强了抗炎细胞因子的表达。

图3. hBMSC-CM对巨噬细胞表型的影响

那么，hBMSC-CM对体内腱-骨愈合的积极作用是否取决于巨噬细胞的存在？为了解答这个问题，研究人员使用了巨噬细胞清除（MC）大鼠，并观察了hBMSC-CM对MC大鼠肩袖腱-骨愈合的影响。通过组织学和生物力学分析，他们发现巨噬细胞清除可促进大鼠肩袖的腱-骨愈合，但在没有巨噬细胞的情况下，hBMSC-CM失去了其优势，表明hBMSC-CM对腱-骨愈合的积极作用依赖于巨噬细胞。

hBMSC-CM通过Smad2/3通路调控巨噬细胞的极化

最后，研究人员探索了hBMSC-CM调控巨噬细胞极化的机制。在LPS刺激后，hBMSC-CM能够显著升高Smad2/3的磷酸化水平，而抑制剂SB431542有效抑制了Smad2/3磷酸化。同时，SB431542显著逆转了hBMSC-CM对巨噬细胞极化的影响。当Smad2/3激活被SB431542阻断后，hBMSC-CM对促炎细胞因子的抑制作用和对抗炎细胞因子的促进作用也被消除。这一现象表明，在炎性环境下，Smad2/3信号通路参与了hBMSC-CM对巨噬细胞极化的调控。

基于这些结果，研究人员认为hBMSC-CM通过促进巨噬细胞向M2表型极化并抑制M1表型，促进了大鼠模型肩袖处的腱-骨愈合。在hBMSC-CM的刺激下，成纤维细胞在腱-骨界面处积累，伴随着纤维软骨（fibrocartilage）的更早形成以及数量更多。再生的止点不仅更加有序，而且具有更好的生物力学性能（图4）。考虑到无细胞hBMSC-CM的安全性，研究人员认为它有望应用于临床来促进腱-骨愈合。

图4. 大鼠肩袖修复后的腱-骨愈合示意图

原文检索

Chen W, Sun Y, Gu X, Cai J, Liu X, Zhang X, Chen J, Hao Y, Chen S. Conditioned medium of human bone marrow-derived stem cells promotes tendon-bone healing of the rotator cuff in a rat model. Biomaterials. 2021 Feb 11;271:120714. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120714. Epub ahead of print. PMID: 33610048.