水稻植株中启动子编辑脱靶效应的全基因组研究

　　

基于CRISPR的基因组编辑工具箱充满了强大的改进。其中最新的一项是prime editing（PE），由David Liu的团队于2019年首次在《Nature》杂志上报道。利用鉴定基因组靶位点的引物编辑指导RNA和融合到逆转录酶的催化不活性Cas9，除了单碱基改变外，引物编辑还可以引入小的插入和缺失。

PE已经应用于动物和植物，但是在基因组位点引入的改变而不是预期位点（非靶向效应）是其应用的主要障碍。导向RNA（gRNA）依赖性脱靶效应源于靶位点与基因组中其他位点之间的序列相似性，而gRNA非依赖性脱靶效应则源于CRISPR工具（如脱氨酶）在基因组中非靶位的异常活动。

中国科学院科学家进行的一项最新研究表明，PE在改变植物基因组DNA方面具有特异性，从而奠定了PE在农业生物技术中的潜力。发表在《自然生物技术》杂志上的这项名为“Genome-wide specificity of prime editors in plants”的新研究报告了对水稻植株中PE的脱靶效应进行了全面的全基因组分析。

作为研究的一部分，研究人员首先检查了植物细胞中主要编辑的错配耐受性，发现编辑频率受主要编辑指导RNA（pegRNA）的引物结合位点和间隔区错配的数量和位置的影响。该研究报道，位于间隔区种子序列区域和Cas9 nickase切痕位点附近的错配降低了PE的频率，这意味着高编辑特异性。

作者证明，设计与较少靶点同源的pegRNAs对于高特异性PE是必要的。他们评估了179个含有错配的内源性非靶向位点的12个pegRNAs的编辑频率，并确认编辑率极低（0.00–~0.23%）。

在以前用一些碱基编辑器检测到的CRISPR工具中，功能元件异位表达引起的gRNA非依赖性效应在硅片中无法预测。因此，由中国科学院遗传与发育生物学研究所（IGDB）教授高彩霞博士领导的研究团队，利用全基因组测序技术，检测到了由于主要编辑基因异位表达而导致的非期望的全基因组编辑。

作者通过对29个PE处理的水稻植株的全基因组序列分析，证实了prime-editors不能诱导全基因组pegRNA非依赖性的脱靶单核苷酸变异或小插入/缺失（indels）。

该研究还表明，莫罗尼小鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV-RT）的异位表达作为PE的一部分，不会改变逆转录转座子（一种复制并粘贴到不同基因组位置的遗传成分）的拷贝数，端粒的结构或导致pegRNA或信使RNA序列插入基因组。这些结果证实，M-MLV-RT，主要编辑机制的核心元件，不干扰细胞内的自然内源性反转录机制。