CRISPR/Cas9基因编辑绕过基因突变，治疗单个基因相关疾病

一种利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的新方法绕过了基因中的致病突变，从而能够治疗与单个基因相关的遗传疾病，如囊性纤维化、某些类型的镰状细胞贫血和其他罕见疾病。该方法包括插入一个新的，完全功能的基因拷贝来取代突变的基因。

　　

一种利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的新方法绕过了基因中的致病突变，从而能够治疗与单个基因相关的遗传疾病，如囊性纤维化、某些类型的镰状细胞贫血和其他罕见疾病。宾州州立大学的研究人员在小鼠和人体组织培养中开发并测试了这种方法，包括插入一种新的，取代突变基因的基因的全功能拷贝。

4月20日发表在《分子治疗》杂志在线版上的一篇论文描述了这种方法的概念证明，CRISPR/Cas9系统允许有前景的新基因治疗，可以针对和纠正基因中的致病突变。在这个过程中，Cas9——一种细菌蛋白——在一个特定的位置切割DNA，在DNA被修复之前，基因序列可以被编辑、修剪或插入一个新的序列。然而，目前的修复策略有两个主要局限性。首先，通常的修复策略称为“同源定向修复”，需要使用细胞内只存在于细胞分裂过程中的特定蛋白质，这意味着基因修复过程不能用于大多数很少发生细胞分裂的成人组织。

“第二个挑战源于这样一个事实，即即使疾病是由单个基因引起的，也可能由该基因内的各种不同突变引起，”Douglas Cavener说，宾夕法尼亚州立大学生物学教授，论文资深作者。”通过同源性定向修复，我们需要为每一个突变设计和测试策略，这可能是昂贵和耗时的。在这项研究中，我们设计了一种称为共选择调节旁路修复（CRBR）的方法，它可以用于分裂和非分裂的细胞和组织，也可以用于基因内的一系列突变。这种方法对于由单个基因引起的罕见遗传病尤其有希望，在这种情况下，有限的时间和资源通常排除了对许多可能引起疾病的突变的设计和测试。”

CRBR利用CRISPR/Cas9系统和一种称为“非同源末端连接”的细胞修复途径插入基因突变基因启动子区域（控制基因何时何地发挥功能的基因序列）与基因突变部分之间的序列。新插入的序列包含正常基因的浓缩版本，用来代替突变版本。插入序列末端的终止序列阻止剩余的下游突变基因被使用。因为CRBR不依赖于同源性定向修复所需的蛋白质，它可以用于所有类型的成人组织。

“我们的方法选择了基因的天然启动子，”宾州州立大学研究生、论文第一作者胡景杰说这意味着新插入的基因在细胞内的表达时间和水平与被替换的基因相同。这是其他基因疗法的优势，它依赖于一个外部启动子来驱动基因的高水平表达，如果在某些生理条件下产生过多或缺少必要的调节反应，则可能导致负面影响。”

研究小组进行了一系列概念验证实验来证明这种方法的实用性。他们首先关注PERK基因，这种突变可能导致一种罕见的疾病，称为Wolcott-Rallison综合征。这种综合征的结果是，父母双方遗传的基因拷贝都发生了突变——这是一种“隐性”疾病——并可导致新生儿糖尿病、骨骼问题、生长迟缓和其他症状。

研究人员将PERK基因插入使用CRBR的健康小鼠体内，并与基因突变的小鼠进行繁殖。结果显示，含有一个CRBR编辑的PERK基因和一个突变的PERK基因的小鼠没有与该综合征相关的典型异常，这表明CRBR编辑的基因可以拯救Wolcott-Rallison综合征小鼠模型中的PERK基因功能，研究人员在实验室对人体组织中的CRBR方法进行了测试，这次测试的重点是胰岛素基因。他们在人尸体细胞的胰岛素基因启动子和胰岛素编码序列之间插入了一个绿色荧光蛋白标记基因序列。实验结果表明，该荧光蛋白在胰岛素分泌细胞中有表达，而在其他细胞中没有表达，说明该序列在胰岛素启动子的调控下受到严格调控研究人员指出，用CRISPR/Cas9进行基因编辑很容易出错。例如，同源性导向的修复策略可能会在编码序列中产生破坏性的突变，如果修复不正确的话。有了cribr，研究人员将目标锁定在一个不编码蛋白质的基因区域内，该区域应该更能容忍这些错误。

“像cribr这样利用CRISPR/Cas9的基因疗法继续面临着将修复机制导入感兴趣细胞的挑战，”卡文纳说一个有希望的发展是从病人身上分离细胞或组织，在实验室修复突变基因，然后将修复后的细胞或组织移植回病人体内。我们希望，随着研究人员不断改进分娩方法，CRBR可以用于治疗Wolcott-Rallison综合征以及其他人类遗传疾病。”

这项工作得到了美国国立卫生研究院和宾州埃伯里理工学院Verne M.Willaman院长的支持

Journal Reference:

1. Jingjie Hu, Rebecca A. Bourne, Barbara C. McGrath, Alice Lin, Zifei Pei, Douglas R. Cavener. Co-opting regulation bypass repair as a gene correction strategy for monogenic diseases. Molecular Therapy, 2021; DOI: 10.1016/j.ymthe.2021.04.017