crispr-DART放大线虫的基因组编辑

MDC的研究人员现在可以诱导不同的基因突变，并在显微镜下的线虫中追踪它们对大规模的影响。该团队在《细胞报告》杂志上描述了他们的体内平行遗传学方法和名为crispr-DART的新分析软件。

　　

 

   

图片:由于微小的秀丽隐杆线虫具有特殊的细胞类型和发育过程，它们非常适合研究人类的基因调控过程。

资料来源:MDC的Rajewsky实验室

理解基因调控区域(基因启动和关闭的DNA和RNA部分)的特定突变的影响，对于阐明基因组如何工作，以及正常的发育和疾病是很重要的。但以系统的方式研究这些调控区域的大量突变是一项艰巨的任务。虽然在细胞系和酵母方面取得了进展，但在活体动物上的研究却很少，特别是在大种群中。

马克斯的实验和计算生物学家Delbrück赫姆霍尔兹协会(MDC)分子医学中心合作建立了一种方法，在多达100万只显微镜线虫中诱导数千种不同的突变，并分析由此对蠕虫的物理特性和功能产生的影响。

“细胞系缺失了发育过程、许多细胞类型以及所有影响基因调控的细胞类型之间的相互作用，”柏林医学系统生物学研究所(BIMSB) MDC基因调控元件系统生物学博士候选人、论文共同第一作者Jonathan Froehlich说。“我们现在可以在重要的环境中测试这些调控序列，并观察其对生物体的影响。”

线虫CRISPR-Cas9应用

微小的秀丽隐杆线虫是研究人类基因调控过程的一个极好的模型。“我们和它们非常相似，”Froehlich说。“它们有专门的组织，它们有肌肉，它们有神经，它们有皮肤，它们有肠道，还有生殖系统。对于基因调控研究来说，你有专门的细胞类型和发育是很重要的。”

为了有效地在大量线虫种群中诱导各种突变，研究人员求助于基因编辑工具CRISPR-Cas9。他们鉴定了多达10个DNA片段将被Cas9酶切割，这种酶被RNA引导到这些点。但研究人员没有发送任何其他指令，让有机体修复突破自然机制的DNA。这将导致以遗传密码缺失或插入形式出现的各种突变，这被称为“indels”。

掷骰子

通常在基因组编辑领域，科学家们希望非常精确地了解一个突变将如何影响一个系统。但在这个旨在同时观察各种突变的实验中却不是这样。

“一部分是可控的，我们设计引导rna并告诉Cas9核酸酶去向的部分，但结果是半随机的，”Froehlich说。“你会有很多不同类型的结果，我们可以看到对动物的影响。”

值得注意的是，研究人员只需要操纵线虫的一个亲本。他们给父母添加了Cas9系统;当这些线虫被暴露在高温下两小时，这种酶开始切割生殖细胞中的DNA。然后雌雄同体的线虫繁殖，导致成千上万的后代含有各种突变。不需要一个接一个地修改线虫的基因组。

crispr-DART 

为了确定成千上万的线虫产生的突变，该团队使用了多种基因组测序技术，产生了大量的数据。为了有效地分析它，他们与MDC的生物信息学和组学数据科学平台合作。

Bora Uyar博士是一名生物信息学科学家，他首先寻找现有的工具来帮助回答必要的问题，例如:Cas9系统是否被激活，DNA的目标区域是否被切断，哪些序列对基因组功能是重要的?Uyar说:“我尝试了现有的工具，没有一个是设计来解决这些问题与如此广泛的数据类型和大量的突变，并产生我们最终想要的交互数据可视化。”

因此，他开始着手设计一种名为crispr-DART(下游分析和报告工具的简称)的新软件包。这是对平行编辑方法的致敬，这种方法不是100%控制的，因此并不总是导致目标区域的突变。“这就是为什么我称它为crispr-DART，你在基因组中投掷一些箭头，工具会告诉你你是否真的成功了，”Uyar说。

该软件可以公开使用，可以处理各种不同的测序数据类型——长读、短读、单读、配对、DNA、RNA。该系统可以快速处理样本，甚至在新类型的信息被添加到混合中，帮助识别有趣的发现，比如协议的效率以及突变与控制相比如何。

MDC生物信息学和组学数据科学平台负责人Altuna Akalin博士说:“crispr-DART遵循了我们在其他管道中使用的原则，可重复性、可用性和信息报告是非常重要的组成部分。”

惊讶的发现

使用新的方案，研究小组能够将几个调控区域的突变与特定的生理效应联系起来。他们也有了一个意想不到的发现。长期以来，人们一直认为，一个名为lin-41的基因中的两个microRNA结合位点共同作用控制基因表达。通过他们的并行编辑系统，该团队在其中一个位点诱导突变，然后在两个位点一起诱导突变。只要其中一个部位完好无损，线虫就能正常发育。但是如果两个位点都发生了突变，基因表达继续不受控制，线虫就不能正常发育而死亡。

MDC柏林医学系统生物学研究所(BIMSB)的科学主任Nikolaus Rajewsky教授监督了这个项目，他说:“这很好地证明了这个系统可以用来研究发育过程中的基因调控。”“我们期待着将这种平行基因组编辑方法应用于更多的问题。”

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