第二篇论文：David Liu的Prime编辑器能在无动物损害的情况下进行精确基因编辑

最新的基因编辑技术Prime编辑扩展了“基因工具箱”，以便更精确地创建疾病模型和纠正遗传问题。

　　

 

   

图片:Xiaochun Long和Joseph Miano，资料来源:奥古斯塔大学乔治亚医学院

科学家们说，最新的基因编辑技术Prime编辑（Prime Editing）扩展了“基因工具箱”，以便更精确地创建疾病模型和纠正遗传问题。

在第二篇发表的关于Prime编辑在小鼠模型中使用的研究中，乔治亚医学院的科学家报告，Prime编辑和传统的CRISPR都成功地关闭了一个参与平滑肌细胞分化的基因，这有助于增强器官和血管的力量和运动。

不同的是，Prime编辑仅剪切双链DNA的单链。分子生物学家Joseph Miano博士说，CRISPR可以进行双链切割，这对细胞是致命的，而且还会在工作场所以及整个基因组中随机产生意想不到的编辑。

“它实际上比传统的CRISPR更复杂，更精确，”Miano说。“Prime编辑比改变游戏规则的基因编辑工具CRISPR具有更少的组件。”

Miano是2013年使用CRISPR改变小鼠基因组的第一波科学家之一。9岁的CRISPR使动物模型得以快速发展，并有可能治愈镰状细胞等遗传疾病，并有可能减少像癌症一样的疾病造成的破坏，在这些疾病中，环境和遗传因素都在起作用。

Prime编辑是最新的基因编辑技术，“Genome Biology”杂志报道了用它来去除平滑肌组织中基因的表达，说明Prime编辑能创建细胞特异性基因敲除小鼠，血管生物学中心分子生物学家Xiaochun Long博士说，如果没有广泛的育种工作，可能无法形成确切的模型。

Long，Miano及其同事在基因Tspan2（一种在细胞表面发现的蛋白质）中使用传统的CRISPR和Prime编辑进行了比较研究。很久以前就发现Tspan2是平滑肌细胞分化中最突出的蛋白质，并可能在心血管疾病中发生突变。她还确定了该基因在培养细胞中的调控区域。但是，尚不清楚该调节区在小鼠中是否重要。

他们使用CRISPR在Tspan2启动子区域内的DNA片段中产生细微变化（三碱基变化），这是灭活基因控制区的标准方法。

CRISPR在三碱基后产生双链断裂，Tspan2基因不再在小鼠的主动脉和膀胱中激活。

然后，他们使用Prime编辑来制作单链断裂或缺口，以及单碱基变化-就像我们体内发生的大多数基因突变一样-并发现这种微妙的变化也使Tspan2基因在主动脉和膀胱中关闭。但没有CRISPR的附带损害。

“我们试图模拟单核苷酸变化可能发生的情况，如果我们仅进行一个碱基改变，Tspan2表达会发生什么？答案是它做了与传统CRISPR编辑相同的事情：它杀死了基因的表达。”

但也有重要的区别。使用CRISPR，他们发现了显着的“插入缺失（indels）”的证据，无论是在进行预期编辑的位点附近还是其他地方，都是意料之外的。

使用CRISPR后多个核苷酸（DNA和RNA的构建模块）出现丢失。Indels是基因组编辑努力避免的意外，因为它们可能导致基因表达缺陷和可能的疾病。如果脱靶，你最终可能会用一种疾病代替另一种疾病。

但是通过Prime编辑，他们在Tspan2启动子区域或其他地方基本上看不到Indels。

曼哈顿图显示了使用这两种技术跨越所有染色体的脱靶，CRISPR的图好像城市里的摩天大楼一样堆叠，而Prime编辑的则相对平坦。

“Prime编辑是对DNA的侵入性较小的切割：没有可检测的插入缺失，没有附带损害。最重要的是，意外后果要少得多，实际上使用起来也不那么复杂。”

传统的CRISPR有三个组成部分，分子剪刀，Cas9，将剪刀带到DNA上的精确位置的引导RNA。传统的CRISPR切割DNA的两条链，这也可能发生在自然界中，对细胞可能是灾难性的，必须迅速修复。

Prime编辑有两个臂，带有修饰的Cas9，称为Cas9切口酶，只能进行单链切割。剪刀与逆转录酶形成称为“Prime编辑器”的复合物，逆转录酶可以用RNA模板产生一块DNA，以在致病突变的情况下替换有问题的片段。PegRNA（prime editing guide RNA）提供RNA模板，获得其需要工作的Prime编辑器，并帮助稳定DNA链。

在修复靶DNA的带切口的链期间，Prime编辑器“复制”包含程序编辑的PegRNA的一部分，在这种情况下为单碱基取代，因此修复的链现在将进行单碱基编辑。在创建疾病模型的情况下，Miano说，这使得科学家能够“偏向”修复，从而创建所需的突变。

化学生物学家David Liu博士和他的同事开发了第一个遵循CRISPR的Prime基因编辑技术。他们在2016年报道了碱基编辑技术，该技术使用被描述为“铅笔，能够直接将一个DNA字母改写成另一个，方法是将一个DNA碱基的原子重新排列成不同的碱基。”David Liu和他的博士后Andrew Anzalone博士在2019年10月《Nature》首次报道了Prime编辑。Liu是这篇《Genome Biology》小鼠Prime编辑论文的合著者。

Liu最初对Prime编辑的研究是在培养环境中完成的，其他人已经在植物中证明了它的有效性。Miano说，这更符合原则。

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科学家们希望更多的同事开始在他们最喜欢的基因中使用Prime编辑技术来积累经验，并加快将其用于人类的进程。

他们的长期目标包括使用安全、特定的基因编辑来纠正人类发育过程中的基因异常，这些基因异常已知会导致毁灭性的畸形和疾病，如心脏缺陷，需要多次大手术才能纠正。

Miano实验室的高级研究助理Allison Yang正在准备使用Prime编辑对罕见和致命的巨膀胱-小结肠-肠蠕动不良综合征进行子宫内矫正，这种综合征会影响膀胱和肠道的肌肉，因此很难移动食物通过胃肠道和排空膀胱。在与CRISPR一起研究血管平滑肌细胞的早期工作中，Miano及其同事无意中创造了一种近乎完美的可杀死胎儿的人类疾病小鼠模型。

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这项新研究的合作者包括来自奥尔巴尼医学院、圣犹大儿童研究医院、康奈尔大学、Synthego和哈佛大学的科学家。这项研究得到了美国国立卫生研究院的支持。