Arraystar Small RNA表达芯片

同时定量检测多种小RNA表达

优势

• 同时筛选主要的small RNA类型：miRNA、pre-miRNA、tRNA、tsRNA和snoRNA
• 提高小RNA表达检测的标准，达到高灵敏度、特异性和准确性
• 简单直接的步骤确保了比small RNA-seq甚至qPCR有更好的无偏差定量
• RNA样本量要求低至100ng
• 特别适合质量RNA样本，如降解的RNA、血清/血浆等体液RNA、FFPE RNA

介绍

Small RNA-seq 已被用于分析 microRNA 和其他小 RNA。然而，利用small RNA-seq 测序数据来量化的小 RNA 的相对丰度与 qPCR/Northern Blot 结果不一致。例如，通过small RNA-seq 测得的 miR-143 的水平比 miR-145 高 40 倍，但通过 qPCR 或 Northern Blot 测得它们的表达水平相当 [1-3]。small RNA-seq 的不准确性主要是由于 small RNA-seq 文库制备和数据分析过程的偏差对结果造成的误导[4, 5]，在某些情况下，与真实丰度的偏差可高达 10,000 倍[6-11]。

SmallRNA定量检测的挑战

RNA修饰的干扰

在测序文库构建和小RNA定量过程中，小RNA内部的修饰会严重干扰cDNA合成。小RNA修饰（例如 m1A、m3C 和 m1G）会阻碍反转录并中止cDNA复制，导致序列偏向于启动端，最终导致构建无偏倚全长序列文库失败。例如，由于tsRNA TΨC 环区域中存在m1A修饰的阻碍，small RNA-seq通常识别 18nt 3'tsRNA，但遗漏了由Northern Blot检测到的更主要的22nt tsRNA异构体（图1）。

图1. cDNA构建所涉及步骤的图示，包括潜在的偏差来源。(A) 具有不同5’端和3’端修饰的非蛋白质编码RNA的起始池，由不同的线型示意性表示。(B) 左图描述了在RNA 5’端连接之前的不同酶预处理，以富集不同的RNA亚型。在各自的5’端预处理后可用于接头连接的RNA类别在每个预处理下示意性表示。右图描述了可用于3’端（-oligo(A)或-oligo(C)尾）和接头连接的RNA类别的亚型。(C)与RNA 5’（左）和3’（右）末端修饰以及cDNA构建的后续步骤相关的可能偏差。

文库扩增的偏差

为了产生足够的 cDNA 量进入测序仪，small RNA-seq需要对文库进行PCR扩增 [12]。然而，RNA G/C 含量、序列组成、二级结构、RNA 长度、启动以及反应条件会导致 PCR 产物的偏差和扭曲。也就是说，当转录组中的不同模板在PCR反应中一起扩增时，模板的偏好或阻滞扩增总是会导致 RNA 无法呈现真实的丰度 [13]。因此，需要多轮 PCR 扩增的small RNA-seq定量从来都不是绝对定量，需要使用正交方法进行验证。

采用TPM衡量small RNA表达水平的潜在问题

TPM(Reads Per Million reads)值通常是small RNA-seq用于表示小 RNA 转录本的相对丰度的指标，简单地用测到的每百万小RNA片段做归一化。然而，在这 100 万次读取中，一个小RNA的读取计数的变化将改变所有其他RNA的TPM值，即使它们实际的绝对表达水平没有改变。

所需样品数量

对于tRNA和tsRNA测序，在文库构建之前，目标RNA的分离和预处理需要 5-100ug[14] 的总RNA，这排除了样本量有限的研究项目。

Small RNA筛选的解决方案

为了克服这些挑战，Arraystar设计了Arraystar Small RNA Array 作为一种实用且有效的解决方案，以高灵敏度和准确度分析全谱small RNA，但需要的总RNA量要少得多。Arraystar small RNA Array 结合直接末端标记和巧妙的探针设计微阵列技术，在一张芯片上同时检测和量化包括miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA和snoRNA在内的小RNA，为研究小RNA的调控功能和生物标志物潜力提供重要的表达信息。

高灵敏度和特异性的探针设计精确定量small RNA

成熟的小RNA，如miRNA和tsRNA，在生成过程中具有非随机、精确切割的末端和确定的RNA大小。

Arraystar Small RNA Microarray 探针旨在最大限度地提高对序列碱基和长度接近的目标RNA检出的灵敏度和特异性。对于成熟体小RNA的探针（图2），5'-CAP发夹结构和固定G位置的C-Cy3标记极大提高了成熟小 RNA 大小和末端的区分能力。 短的特定探针区域与杂交时的最佳探针/靶点Tm匹配。

由于小RNA前体倾向于形成更稳定的分子内二级结构和相对较低的前体RNA水平，成熟的小RNA探针具有出色的特异性，可以区分成熟与前体小RNA。对于前体/更长小RNA的探针（图3），被设计为特异性结合pre-miRNA、tRNA和snoRNA的特有序列。

对于芯片收录的miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA和snoRNA，即使只有一两个碱基的差异，探针组也能准确检测和量化。

图2. 成熟体小RNA的探针。从 5'->3'，(A) 5'-Cap段形成发夹结构，以阻止较长尺寸的序列，如前体、退火异构体的结合。(B)探针杂交区第一个碱基位置的固定G与目标RNA 3'端的C-Cy3标记碱基配对，形成更稳定的GC-夹子。(C)短的~20-nt探针特异性结合区域利用最佳Tm进行标准化，以区分仅具有1~2个碱基差异的相似RNA。(D) 3'-Linker 提供了空间，防止玻片表面产生空间位阻。

图3. 小RNA前体探针。~20-nt短探针结合区使用前体pre-miRNA、tRNA和snoRNA的特有序列进行了Tm值优化。

Small RNA末端直接标记

为了对用于芯片筛选的小RNA进行荧光标记，用T4多核苷酸激酶(T4 PNK)处理总RNA，从3'端去除单磷酸(P)和环磷酸(cP)基团，暴露3-OH末端。添加二甲基亚砜(DMSO)作为变性剂，尽量减少小RNA二级结构和序列构成差异的影响。然后通过T4 RNA连接酶将小RNA与pCp-Cy3连接到3'末端。一个RNA分子被一个Cy3标记（图4）。

图4. Small RNA的直接末端标记。具有3'-P或3'-cP末端的RNA用T4多核苷酸激酶(T4 PNK)去磷酸化以形成3-OH末端。添加DMSO以减少RNA结构对标记的影响。pCp-Cy3通过T4 RNA连接酶连接到RNA的3'-OH。每个RNA末端都被精确标记。

末端标记优势

更好的无偏差定量  Small RNAs在其3’-OH端直接与Cy3染料连接，完全避免RNA预处理去除内部RNA修饰，由于RNA修饰和RNA二级结构导致的逆转录失败，以及有偏倚的PCR扩增步骤的影响。所有这些都有助于保持Small RNA水平的保真度，并实现比RNA-seq甚至qPCR更好的无偏的高定量精度。

RNA样本量要求较低  直接进行RNA末端标记，没有RNA预处理导致的RNA损失，显著减少RNA总量需求，特别是对高度修饰的Small RNA(如tRNA和tsRNA)。Arraystar Small RNA Microarray对样本量需求低，为样本量少的研究提供了机会。

质量较低的RNA样本也能检测  Arraystar small RNA芯片的RNA直接末端标记对底物RNA序列中的核苷酸损伤相对不敏感，因为它不依赖于逆转录cDNA复制。这与Small RNA-seq形成鲜明对比，Small seq容易受到Small RNA序列的任何核苷酸损伤的影响。此外，虽然芯片探针不受不相关序列存在的影响，但降解RNA样本中丰富的rRNA片段可以污染相似大小的Small RNA，抑制Small RNA-seq中的Small RNA检出。

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Arraystar Small RNA 芯片列表

服务名称	描述	规格
Arraystar Human Small RNA 芯片	miRNAs, pre-miRNAs, tsRNAs, tRNAs和snoRNAs	8 x 15K
Arraystar Mouse Small RNA 芯片	miRNAs, pre-miRNAs, tsRNAs, tRNAs 和snoRNAs	8 x 15K

References
[1] Kent OA. et al (2010) “Repression of the miR-143/145 cluster by oncogenic Ras initiates a tumor-promoting feed-forward pathway” Genes Dev 24(24):2754-9 [PMID:21159816]

[2] Chivukula RR. et al (2014) “An essential mesenchymal function for miR-143/145 in intestinal epithelial regeneration” Cell 157(5):1104-16 [PMID:24855947]

[3] Akao Y. et al (2007) “Downregulation of microRNAs-143 and -145 in B-cell malignancies” Cancer Sci 98(12):1914-20 [PMID:17892514]

[4] Raabe, C. A., et al. (2014) "Biases in small RNA deep sequencing data" Nucleic Acids Res 42(3):1414-26 [PMID: 24198247]

[5] Witwer, K. W. and Halushka, M. K. (2016) "Toward the promise of microRNAs - Enhancing reproducibility and rigor in microRNA research" RNA Biol 13(11):1103-1116 [PMID: 27645402]

[6] McCormick, K. P., et al. (2011) "Experimental design, preprocessing, normalization and differential expression analysis of small RNA sequencing experiments" Silence 2(1):2 [PMID: 21356093]