周斌组合作揭示心脏损伤后肌成纤维细胞的来源及形成过程

　　

　　12月21日，国际学术期刊Circulation发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌组、上海交通大学新华医院孙锟教授以及香港中文大学吕爱兰教授合作的研究成果“Seamless Genetic Recording of Transiently Activated Mesenchymal Gene Expression in Endothelial Cells During Cardiac Fibrosis”。该研究利用遗传谱系示踪技术无缝隙记录心脏内皮细胞中间充质基因的激活，揭示了胚胎期心内膜内皮细胞向间充质细胞转变的过程（Endothelial to Mesenchymal Transition, EndoMT），发现在成体心脏损伤后纤维化过程中，大量的肌成纤维细胞不是由内皮细胞通过EndoMT形成，而是来源于成纤维细胞的激活和转变形成的，其过程有间充质基因的瞬时表达。

　　近20年来，关于成体心脏纤维化过程中肌成纤维细胞的来源一直存在争论，前期代表性研究发现成体心脏纤维化中内皮细胞会通过EndoMT转分化为间充质细胞（Zeisberg et al., Nature Medicine 2007），形成大量的肌成纤维细胞促进心脏纤维化，成为治疗心脏纤维化的一个重要靶点。该结论主要是基于Cre-loxP单同源重组酶的谱系示踪技术，存在时空分辨率较低，并可能有示踪假阳性的技术问题。此外，目前也没有技术能研究在成体心脏纤维化中内皮细胞是否会发生可逆的EndoMT，短暂或瞬时地表达间充质细胞的基因，由于缺乏研究手段并不清楚。

　　基于双同源重组酶介导的谱系示踪技术（He et al., Nature Medicine 2017），研究人员建立了无缝隙捕捉间充质基因激活的技术—EndoMTracer。αSMA是肌成纤维细胞的特征蛋白，也是指征间充质细胞最常用的分子标记之一（Tallquist et al., Nat Rev Cardiol 2017），因此研究人员首先检测内皮细胞中是否会激活表达αSMA。当对小鼠用他莫昔芬诱导后，通过Cre-loxP重组，内皮细胞会被特异地标记上ZsGreen的荧光蛋白，同时内皮细胞中αSMA-LSL-Dre转变成αSMA-Dre。在随后的时间段内，只要内皮细胞短暂或瞬时的激活αSMA，那么就会表达出Dre重组酶，并发生Dre-rox重组，将该内皮细胞永久的标记上tdTomato的荧光蛋白。EndoMTracer系统一旦通过他莫昔芬诱导，后续就可以持续地记录内皮细胞中αSMA的激活，tdTomato阳性代表着该内皮细胞在检测时间段内激活过αSMA。

　　研究人员首先利用EndoMTracer技术捕捉胚胎期心内膜向间充质细胞转变的过程。在母鼠怀孕8.5天后用他莫昔芬诱导EndoMTracer系统开启，并收集17.5天的胚胎心脏样本进行分析。研究人员在瓣膜处检测到tdTomato阳性的间充质细胞，但不表达αSMA，说明这些被标记的内皮细胞曾经表达过αSMA，发生EndoMT，并被EndoMTracer技术永久地记录下来。

　　接下来，研究人员利用EndoMTracer技术捕捉成体心脏纤维化中EndoMT过程。对成体小鼠用他莫昔芬诱导后，研究人员采用了不同的损伤模型来诱导心脏纤维化过程：主动脉缩窄术和心肌梗死。在这两种心脏损伤模型的不同时间点，均未检测到tdTomato阳性的内皮细胞，说明成体心脏内皮细胞在纤维化过程中，不会瞬时激活间充质细胞的特征基因αSMA，继续保持着内皮的特征。

　　机体损伤后，成纤维细胞被激活转变为肌成纤维细胞，表达αSMA，促进损伤区域的纤维化。研究人员利用相同的策略捕捉成纤维细胞中αSMA的激活表达。在小鼠心脏损伤后，研究人员检测到在纤维化明显的区域出现大量tdTomato阳性的细胞，这些成纤维细胞同时表达αSMA。在损伤后期，成纤维细胞不再表达αSMA，但仍然标记为tdTomato阳性，表明成纤维细胞中短暂表达的间充质基因αSMA被EndoMTracer永久地记录下来。

　　研究人员接着采用了另一个间充质的特征基因Zeb1，捕捉心脏内皮中Zeb1的激活表达。胚胎期心内膜EndoMT中表达过Zeb1的内皮细胞被EndoMTracer永久地标记为tdTomato阳性。但是，成体心脏损伤纤维化后，研究人员没有检测到明显的tdTomato信号，说明心脏纤维化过程中，内皮细胞不会瞬时激活Zeb1的表达。而部分成纤维细胞能短暂表达Zeb1，在心脏纤维化过程中被EndoMTracer永久记录下来。

　　综上，该工作建立了无缝隙捕捉特定基因转录激活的技术，揭示了在早期胚胎心脏发育中内皮细胞向间充质细胞转变的过程，但成体心脏纤维化中内皮细胞不会发生瞬时EndoMT，也不会形成肌成纤维细胞。心脏中的成纤维细胞在损伤过程中会被激活，表达间充质基因，并促进损伤区纤维化，提示心脏纤维化的治疗靶点应集中在成纤维细胞。

　　分子细胞卓越中心博士研究生张少华为该论文的第一作者，分子细胞卓越中心周斌研究员、上海交通大学新华医院孙锟教授以及香港中文大学吕爱兰教授为该论文共同通讯作者。该工作得到了英国阿斯利康Qing-dong Wang教授，上海交通大学陈丰原教授的大力支持。感谢分子细胞卓越中心动物平台和细胞分析技术平台对本研究的大力支持，感谢中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部门的经费支持。

　　文章链接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.121.055417

　　图：研究人员利用EndoMTracer技术揭示了胚胎期心内膜向间充质细胞转变的过程存在EndoMT，但成体心脏损伤后内皮细胞不会发生EndoMT, 成纤维细胞的激活和转变形成了损伤区的大量肌成纤维细胞，会瞬时表达间充质细胞的基因，促进心脏纤维化及病理重塑。