RIBOTAC技术开启RNA降解的新时代

　　

PROTAC被称为蛋白质水解-靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras）。

它是一种有别于抗体和传统小分子抑制剂的新兴药物类型。

PROTAC领域经过近年来的快速发展，取得了长足的进步。

目前，许多项目已进入临床开发阶段，这为解决传统小分子耐药和靶向非药靶蛋白带来了前所未有的机遇。

与用于蛋白质靶向降解的PROTAC技术类似，用于RNA靶向降解的RIBOTAC技术也正在兴起。

RIBOTAC其功能是将目标RNA“带到”RNase进行降解。

10月27日，在《Science Translational Medicine》杂志上发表的一项研究中，RIBOTAC技术先驱、斯克里普斯研究所的Matthew Disney教授带领团队设计了一种可降解肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和颞叶痴呆(FTD)致病性RNA[1]的RIBOTAC分子。

在患者源性脊髓神经元和ALS小鼠模型中，RIBOTAC分子成功诱导致病性mRNA降解并减少相关病理。

在过去的15年里，Disney教授一直致力于研究RNA分子的药物结构，并建立了一个可以结合这些药物结构的化合物库。

RIBOTAC的成功发展就是建立在这些基础上的。

2019年，Disney教授在《Cell Chemical Biology》上发表了一项关键成果，描述了他们开发的具有抗癌潜力和介导选择性RNA降解[2]的核糖核酸(RIBOTAC)分子。

RIBOTAC的发展是基于小分子，可以选择性地结合RNA(特别是RNA，可以形成复杂的二级和三级结构)。

其关键创新在于通过连接核糖核酸酶(RNase)招募分子，将RNA结合分子转化为RNA结合分子。RNA分子降解。

(A)核糖核酸(RIBOTAC)是一个二价分子，包含一个RNA结合模块(绿色)，一个核糖核酸酶(RNase)招募模块(橙色)和一个连接(黑线);RIBOTAC一旦与靶RNA结合，就会在靶RNA附近招募RNase，从而促进其降解。(B) PROTAC也是一种二价分子，其中蛋白质结合配体(红色)通过连接子(黑线)连接到E3连接酶募集模块(黑色)。PROTAC将E3连接酶定位在靶蛋白附近，导致靶蛋白多泛素化，最终靶蛋白被细胞蛋白酶体机制降解。(来源:Cell Chemical Biology)

具体来说，这篇《Cell Chemical Biology》文章描述了能够介导pre-miR-210选择性降解的核糖核酸(RIBOTAC)分子TGP-210-RL。

TGP-210-RL是由TGP-210衍生而来，TGP-210是Disney团队先前开发的一个可以结合pre-miR-210的小分子。

TGP-210与四-腺苷酸结合形成TGP-210-RL。四聚腺苷酸类似于病毒感染期间细胞产生的内源性寡聚腺苷酸。

低聚腺苷酸激活潜在的RNA酶L，使其二聚形成活性核糖核酸酶。

Pre-miR-210是一个有吸引力的治疗靶点，因为它是microRNA miR-210的前体，而microRNA miR-210对于低氧环境下的癌症生存至关重要。

在本研究中，Disney教授和他的合作者证实了TGP-210-RL可以诱导TGP-210-R + microRNA前体+ RNase L三元复合物的形成。

在低氧癌细胞中，TGP-210-RL诱导miR-210水平显著降低和凋亡，证明了RIBOTAC在癌细胞中靶向和降解RNA靶点的潜力。

RIBOTAC的第二篇重要论文发表在今年8月的Journal of the American Chemical Society (JACS)上[3]。

在这项研究中，科学家将RTK抑制剂dovitinib转化为一种靶向RNA降解的小分子核糖核酸(RIBOTAC)。

研究已经证实，针对pre-miR-21 (microRNA-21的前体)降解的RIBOTAC，在三阴性乳腺癌和Alport综合征(遗传性肾炎)小鼠模型中减轻疾病进展。

基于dovitinib修饰的RIBOTAC分子对pre-miR-21的选择性提高了2500倍。

来源:江淮

在《Science Translational Medicine》杂志上发表的最新研究中，Disney教授的团队主要关注神经退行性疾病ALS和FTD。

肌萎缩性侧索硬化症和FTD都是进行性神经退行性疾病，可导致运动和认知障碍。

这些疾病通常是散发的，最常见的相关突变是六核苷酸重复扩增（HRE），GGCC重复扩增，9号染色体开放阅读框72（C9orf72）中的一个内含子（通常是内含子1），导致疾病的重复次数从60到数千次不等。

这种疾病的亚型被称为c9ALS/FTD。

含有HRE的RNA被翻译成含有不同二肽重复序列的蛋白质，通常是poly(GP)或poly(GA)。poly(GP)是聚甘氨酸-脯氨酸，poly(GA)是聚甘氨酸-丙氨酸。含有HRE的RNA及其含有二肽重复的翻译蛋白被认为促进了神经元的死亡。

这种RNA和蛋白质可以形成毒性聚集体，RNA可以阻断基因表达机制。

基于这些早期发现，科学家们认为，如果能够消除含有HRE的RNA，可能会为疾病的治疗带来新的机会。

与靶向蛋白相比，靶向这种致病RNA具有“一箭双雕”的效果。

含有HRE的RNA还有另一个值得研究的特征:这种类型的RNA会形成一个特殊的3D结构。瞄准这种特殊的3D结构(而不是主要序列)可能会减少瞄准其他较短的HREs。非致病性mRNA产生的脱靶效应。

利用结构-活性关系结合生物物理学和结构分析，Disney教授和他的同事首次设计了一种小分子二聚体化合物，可以与上述特殊的3D RNA结构结合。

每个单体都被整合到RNA发夹的内环中。二聚体的结合Kd为4±0.7 nM，在靶RNA上停留时间较长。

化合物6是一个二聚体RNA结合模块，RNase L招募模块没有连接;(B)化合物7是一个与RNase L募集模块耦合的核糖核酸(RIBOTAC)分子，化合物8是与一个对照，即效率较低的RNase L募集模块耦合。(来源:Science Translational Medicine)

然后，在二聚体的基础上，Disney教授的团队添加了核糖核酸酶(RNase L) L招募模块，将小分子二聚体转化为核糖核酸核糖核酸(RIBOTAC)分子。在HEK293T细胞中，其核糖核酸(RIBOTAC)分子抑制了翻译，并以一种需要RNase L的方式，依赖于剂量降低了含有HRE的RNA水平。

此外，RIBOTAC分子还缓解了c9ALS/FTD患者源性细胞株的病理特征，降低了患者源性淋巴母细胞和iPSCs中C9orf72内含子1的丰度，降低了iPSCs中二肽重复蛋白的水平。

同样的减少也可以在ipsc来源的脊髓神经元中看到(iPSNs，它可以复制c9ALS/FTD患者脑组织的许多遗传、转录和生化特征)。

本研究未观察设计的RIBOTAC分子对其他转录本的影响。

由于前期大量研究指出c9ALS/FTD患者的核孔蛋白会减少，因此本研究还研究了RIBOTAC治疗对核孔蛋白水平的影响。

通过超分辨显微镜，迪斯尼教授等人发现RIBOTAC恢复了关键的核孔蛋白Nup98的水平。

在临床前小鼠模型中，r(G4C2)exp靶向RIBOTAC 7可以减少c9ALS/ftd相关的毒性(来源:Science Translational Medicine)

在c9ALS/FTD小鼠模型中，单次脑室内注射RIBOTAC可显著降低r(G4C2)- mRNA、r(G4C2)-焦点和poly(GP)-蛋白水平。

这些影响可以在注射后1周观察到，并持续到治疗后至少6周(即整个研究期间)。通过免疫组化分析，RIBOTAC还降低了c9ALS/FTD的已知特征，包括多聚(GP)和多聚(GA)聚集，以及TDP-43的细胞质含量。

科学家认为，尽管RIBOTAC的临床应用需要进一步优化其药物化学和物理化学特性(这一过程可能需要数年时间)，这一新结果为RNA的靶向降解提供了另一个关键证据，它是可行的，可能是治疗RNA起关键致病作用的疾病的最佳方法。

在临床翻译方面，早在2016年，Disney教授就以科学创始人的身份创立了生物技术公司Expansion Therapeutics，致力于研发治疗RNA介导疾病的小分子药物。

今年9月，该公司刚刚完成了8000万美元的B轮融资，巨头诺华和赛诺菲将继续支持该公司。

扩展目前的重点是神经退行性疾病，包括前面提到的c9ALS/FTD。

总结

多种RNA，包括mRNA、miRNA和长链非编码RNA，都与疾病相关，因此它们是潜在的药物靶点。

作为一种新型分子，RIBOTAC具有靶向不同类型RNA的潜力。它可能比已经开发的用于降解RNA的反义寡核苷酸(ASO)和siRNA有一定的优势，包括:

1)更好的药物作为小分子，RIBOTAC可能进入更广泛的组织范围，而ASO和siRNA存在细胞摄取差、组织特异性传递差(肝脏和肾脏除外)、核内体逃逸差等问题。

2)低用量:RIBOTAC的催化性能是另一个主要优势。在核糖核酸结合并诱导一种RNA降解后，它可以与另一种RNA结合。

这样就可以利用低浓度的RIBOTAC来实现对目标RNA的降解。

然而，RIBOTAC也面临着难以发展的挑战。最困难的部分是开发小分子，选择性地结合到目标RNA细胞。

与反义寡核苷酸相比，开发合适的RNA结合配体要困难得多，因为前者可以通过简单的编程，利用互补序列与目标RNA结合。

此外，RIBOTAC还面临早期PROTAC的挑战，即由于其分子量大，细胞吸收差，生物利用度低(TGP-210-RL的分子量为> 2000)。

与TGP-210相比，细胞摄取减少了50%)。

RIBOTAC的进一步迭代可能涉及到寻找更小的RNase结合配体。值得注意的是，文献中已经有关于RNase L小分子激活剂的报道。

参考文献：

[1]JESSICA A. BUSH et al. Ribonuclease recruitment using a small molecule reduced c9ALS/FTD r(G4C2) repeat expansionin vitro and in vivo ALS models. SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE(2021).

[2] Matthew G. Costales et al. Targeted Degradation of a Hypoxia-Associated Non-coding RNA Enhances the Selectivity of a Small Molecule Interacting with RNA. Cell Chemical Biology(2019).

[3]Peiyuan Zhang et al. Reprogramming of Protein-Targeted Small-Molecule Medicines to RNA by Ribonuclease Recruitment.JACS(2021).

[4] Degrading disease-causing RNA in ALS (Source: Nature Reviews Drug Discovery)

[5] Potential treatment for ALS, frontotemporal dementia targets RNA (Source: Scripps Research Institute)

[6] RIBOTACs: Small Molecules Target RNA for Degradation (Source: Cell Chemical Biology)

[7] Small-molecule selectively destroys cancer-associated RNA (Source: C&EN)

[8] Neuron | Sun Shuying’s team reveals the mechanism by which the RNA helicase DDX3X regulates the translation of C9ORF72 (Source: BioArt)

[9] Expansion Therapeutics Raises $80 Million Series B Financing to Treat Neurodegenerative Diseases (Source: Expansion)

RIBOTAC technology may start a new era of RNA degradation

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