陈飞团队《Molecular Cell》揭示真核生物转录机器在转录早期命运决定的机制

　　

 基因表达的精准调控，对机体发育和细胞的各种生理功能的维持至关重要。基因表达的紊乱，则影响着众多的生理和病理过程。转录是基因表达调控最关键的步骤，因此转录调控机制的研究一直是分子生物学的核心课题。真核生物大多数基因的转录主要分为转录起始（initiation）、暂停（pausing）、延伸（elongation）和终止（termination）四个步骤，每个步骤都涉及到RNA聚合酶II（Pol II）与对应的转录起始因子、延伸因子或终止因子之间的相互作用和调控。

 转录延伸因子SPT5（细菌的同源蛋白为NusG/RfaH）是唯一在所有生物中都保守的转录调节因子。NusG/RfaH在细菌的转录和翻译的偶连中起到了重要作用（详见BioArt报道：3篇Science | 转录和翻译的一次“牵手”——“红娘” NusG 背后的故事），在真核生物中SPT5会与SPT4形成DSIF复合物来调控Pol II转录的延伸（transcription elongation）。有趣的是，SPT5在多细胞生物中又演化出调控启动子近端Pol II暂停（promoter-proximal Pol II pausing）的功能。

 Pol II在转录起始后延伸到20-100 bp后暂停的现象被称为启动子近端Pol II暂停，这是转录调控的核心；该区域的稳定主要依赖于negative elongation factor (NELF)，DRB sensitivity-inducing factor (DSIF)和Pol II-associated factor 1 (PAF1)等复合物来维持。暂停的Pol II在暂停之后，会在“有效的转录延伸（productive release）”和“早期终止 (early termination)”两种命运之间进行选择。当激酶复合物p-TEFb被招募到pausing位点后，它能磷酸化Pol II CTD、DSIF和NELF，使得NELF解离；随后暂停的Pol II被转录延伸因子DSIF等激活，从而进入高效的转录延伸阶段（productive elongation）。

 激酶p-TEFb可介导SPT5的第666位点丝氨酸S666和CTR1-T806的磷酸化，而Integrator-PP2A (INTAC)可能做为SPT5的磷酸酶。激酶和磷酸酶如何拮抗SPT5的磷酸化状态以及是如何精确调控核心的转录机器还有待研究。

 2021年9月16日，我院陈飞课题组在Molecular Cell杂志上在线发表题为SPT5 stabilizes RNA polymerase II, orchestrates transcription cycles, and maintains the enhancer landscape的研究论文。该项研究利用诱导型蛋白降解系统dTAG并结合转录调控高通量研究方法，发现转录调控因子SPT5能够直接促进转录机器的蛋白质稳定性；在转录层面，SPT5能够调控增强子（enhancer）活性，稳定暂停的Pol II，并促进暂停Pol II的释放、转录延伸和转录终止。其中，SPT5第666位的丝氨酸（S666）的磷酸化特异性促进暂停Pol II的释放，而CTR1的磷酸化特异性调控转录终止。同时，这两个位点均能被磷酸酶INTAC去磷酸化，说明了SPT5介导的INTAC的功能。

 ROTACs由靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体和连接链三部分组成，该分子能分别识别靶蛋白和E3泛素连接酶来诱导靶蛋白的多聚泛素化，从而使靶蛋白能够被蛋白酶体识别并降解。dTAG是一种能将CRBN泛素连接酶和FKBP12F36V连接起来的新化合物，该系统只要将FKBP12F36V与目标蛋白融合就能实现对其快速且特异的降解。

 为了研究SPT5蛋白对基因转录直接的调控作用，该研究利用CRISPR-Cas9系统构建了FKBP12F36V-SPT5（SPT5-dTAG）细胞系，从而可以对内源SPT5蛋白进行动态调控。比较意外的是，随着SPT5蛋白的降解，RNA 聚合酶II最大的亚基RPB1蛋白也随之减少，并且RPB1 pSer5（与启动子暂停pausing相关）减少的量比RPB1 pSer2（与转录延伸相关）的大；用ChIP-Rx也验证了这一结果，说明细胞水平和染色质水平上的RPB1均减少。进一步研究发现RPB1蛋白的减少是通过泛素化降解途径进行的。

 PRO-seq (Precision nuclear run-on sequencing)技术是以单个碱基的分辨率检测转录Pol II的定位和转录活性的高精度转录调控研究方法。利用PRO-seq技术分析SPT5蛋白快速降解的细胞系发现：1）基因启动子暂停的Pol II急剧减少，基本没看到pause release的想象；2）转录的持续性（processivity）显著降低；3）在基因转录终止的区域有明显的转录 “顺读”（transcription readthrough）。这些结果说明SPT5在维持暂停Pol II蛋白的稳定性、转录延伸和转录终止等方面有重要的调控作用。

 增强子（enhancer）能通过在时空上精确的调控靶基因的表达。它的转录也依赖于Pol II，基于上述SPT5蛋白对mRNA基因转录的调控作用，促使研究人员去探究其对增强子转录活性的影响。通过ATAC-seq 分析发现 SPT5蛋白的缺失造成了约25%的增强子染色质的可及性（chromatin accessibility）显著下降。通过H3K27ac，MED1和BRG1（染色质重塑复合物BAF的催化亚基）的ChIP-Rx分析，它们在增强子上的信号也减弱。以上结果说明SPT5也能调控增强子的转录活性。

 SPT5做为最保守的转录调节因子，激酶p-TEFb能催化SPT5 S666和CTR1位点的磷酸化。为了回答这两个修饰的对转录的调控作用，研究人员分别用这两个突变位点的SPT5蛋白（SPT5 S666A，SPT5 CTR1-T4A）做了回补实验。发现SPT5 S666A会使启动子区暂停Pol II（pausing）信号增强而基因内部Pol II信号减弱，提示SPT5 S666的磷酸化可能跟Pol II的释放（release）有关；SPT5 CTR1-T4A则让基因转录终止信号提前，说明SPT5 CTR1磷酸化与转录终止相关。有意思的是，这两个位点的磷酸化均能被磷酸酶INTAC去除，提示INTAC在转录暂停和转录终止这两个阶段发挥着重要的作用。

 综上所述，SPT5蛋白分别从影响增强子的转录活性、Pol II蛋白的稳定性、转录暂停（pausing）、延伸（elongation）和终止（termination）等方面来调控转录核心机器的运转，为将来研究其生理病理的功能提供理论指导。

 据悉，复旦大学附属肿瘤医院助理研究员胡士斌、博士后彭林娜和徐从玲为本文共同第一作者，博士生王振宁和宋爱霞对本文也有重要的贡献，陈飞为本文的通讯作者。TT-seq实验得到武汉大学梁凯威教授和王红红同学的帮助。

 值得一提的是，近日美国西北大学Ali Shilatifard课题组在Molecular Cell杂志上在线发表题为SPT5 stabilization of promoter-proximal RNA polymerase II的研究论文。该研究解析了SPT5蛋白缺失后RPB1蛋白的降解机制，发现E3泛素连接酶CUL3和解折叠酶VCP是必需的。该研究与陈飞团队第一部分的发现一致。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.029