CRISPR iStop基因敲除系统

基于CBE定点编辑，精确“KO”细胞

▪ 无需DNA双链断裂
▪ 极低非特异编辑风险
▪ 精确定点突变敲除基因
▪ 对细胞干扰最小

iStop技术基于CRISPR单碱基基因突变技术CBE（CRISPR-dependent cytosine base editor）。CBE技术在不依赖DNA双链断裂的前提下，特异性实现基因组C>T碱基突变，将CBE技术应用于基因敲除时，可以实现精确地将四个密码子（CAA、CAG、CGA 和 TGG）转换为终止密码子（TAA、TAG、TGA）。

现有的基因编辑技术，无论是非同源重组的邻端连接法还是同源重组法，都需要先造成DNA双链断裂，导致细胞DNA修复机制发挥作用，从而造成DNA缺失或者外源片段插入。而DNA双链断裂是严重的细胞损伤，会激活广泛的细胞损伤修复机制或者细胞应激甚至死亡。而iStop基因敲除最大的有点在于非常温和，仅改变指定位置的单个碱基，不会造成DNA双链断裂，不影响细胞状态，不造成细胞应激。编辑结果精确可控。

英茂盛业在CBE技术的基础上，通过优化表达结构和sgRNA结构，大幅提高了Cas9蛋白和sgRNA表达效率和编辑效率，仅需要质粒瞬时表达就可实现高效基因编辑。编辑后不残留质粒，不会在细胞基因组插入任何外源DNA和筛选标记，实现真正的无痕基因编辑。

英茂盛业现有超过2000个已验证iStop基因敲除载体，成功编辑细胞株200株，可为您提供从方案设计，靶点筛选及细胞筛选等多种服务。欢迎拨打023-67630383或者微信：13681365274咨询。

基因编辑流程：

1、iStop基因敲除sgRNA表达载体构建
服务编号：SK01
服务价格：1800元/靶点
周期：2周

服务内容：客户提供靶点序列。我方构建该靶点表达载体。
服务标准：载体测序结果与设计一致。
服务适用：本服务适用于已有有效靶点的客户。靶点可以来自可靠的文献资料或者客户自己验证的结果。
 
2、iStop基因敲除靶点筛选及载体构建服务
服务编号：SK02
服务价格：4500元/套
周期：4周

服务内容：设计并构建3-5个靶点表达载体，与CRISPRCBE载体一起瞬转HEK293V细胞。基因组PCR测序验证靶点基因敲除效率。提供至少一个有效靶点及有效靶点的sgRNA表达载体。
服务标准：1、载体测序结果与设计一致。2、基因组PCR测序结果确定靶点有效。
服务适用：本服务适用于尚未设计基因敲除靶点，且有丰富的细胞培养转染、细胞单克隆筛选和检测经验的客户。

3、iStop基因敲除多克隆细胞株服务
服务编号：SK03
服务价格：8800元/株（HEK293）；9800元/株（常见肿瘤细胞，转染效率大于30%）；其他细胞株询价
周期：6-8周

服务内容：前期靶点设计及验证同SK02。验证完成后转染细胞株并用抗生素筛选阳性克隆，基因组PCR测序验证基因敲除效果。提供含基因敲除阳性细胞的细胞pool。
服务标准：基因组PCR测序结果确定基因敲除有效。
服务适用：本服务适用于尚未设计基因敲除靶点，且有细胞单克隆筛选和检测经验的客户。

4、iStop基因敲除单克隆细胞株服务
服务编号：SK04
服务价格：14000元/株（HEK293）；18000元/株（常见肿瘤细胞，转染效率大于30%）；其他细胞株询价
周期：12-14周

服务内容：筛选多克隆株同SK03。获得多克隆株后通过有限稀释法分选单克隆细胞株。基因组PCR测序检测单克隆株基因敲除结果。提供含目的基因双等位基因敲除单克隆细胞株。
服务标准：基因组PCR测序结果验证敲除成功。
服务适用：本服务适用于经费充足，实验人手不足的客户。

服务优势：

1)技术成熟。我司具有多年的基因编辑技术经验和稳转细胞株构建服务经验，可提供从项目设计到实施的完整服务。
2)已制备多种Cas9蛋白突变体，进一步扩展了CRISPR基因敲除的靶点选择范围，基本上现有基因均可设计iStop基因敲除靶点。

iStop基因敲除实例：在HEK293V细胞株敲除CD274基因

1.靶点设计及筛选

    由于CD274基因蛋白仅有274个氨基酸，编码序列较短，采用常规Cas9的NGGPAM序列设计靶点较为困难。我们采用了Cas9的突变体Cas9-spRY进行实验。Cas9-spRY的PAM序列为NRY，大幅增加了可选择的靶点数量。

设计的靶点序列如下：

靶点编号		DNA序列	氨基酸序列
1	编辑前	aaaacaattagacctggctg cac	EKQLDLAA
	编辑后（理论）	aaaataattagacctggctg cac	EK*LDLAA
2	编辑前	ttattcaatttgtgcatgga gag	IIQFVHGE
	编辑后（理论）	ttatttaatttgtgcatgga gag	II*FVHGE
3	编辑前	aaggttcagcatagtagcta cag	KVQHSSYR
	编辑后（理论）	aaggtttagcatagtagcta cag	KV*HSSYR
4	编辑前	aaggaccagctctccctggg aaa	KDQLSLGN
	编辑后（理论）	aaggattagctctccctggg aaa	KD*LSLGN

2.靶点设计及筛选瞬转HEK293V细胞筛选靶点

     构建好的4个靶点表达载体与Cas9-SpRY-CBEMax载体共转染HEK293V细胞。提取细胞基因组，进行PCR测序。结果如下：

结果显示靶点1、2没有效果。靶点3、4突变效果明显。
 
3.采用靶点3制备单克隆细胞株，并且对细胞克隆的CD274基因进行基因组PCR测序检测。

结果显示该克隆中CD274基因敲除成功

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