《Cell》子刊专家点评利用单细胞测序技术解析免疫治疗联合化疗新机制的研究论文

　　

2021年11月11日，来自美国哈佛医学院、哈佛大学路德维希中心、麻省总医院癌症中心的乳腺肿瘤内科主任Leif W. Ellisen教授在国际期刊《Cancer Cell》以Preview的形式对该杂志本期发表的题为“Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple negative breast cancer”的研究论文进行了评论综述。

该评论指出，免疫检查点阻断(ICB)疗法加化疗正日益成为部分三阴性乳腺癌 (TNBC)患者的标准治疗方案。在本期《Cancer Cell》发表的研究论文中，来自中国学者的标题为“Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple negative breast cancer”的研究，对治疗前和治疗后TNBC患者体内免疫细胞进行了系统深入的单细胞解析，揭示了T细胞活化的潜在机制和免疫进化模式，为开发新的预测响应及临床获益的生物标志物提供了重要指导和理论依据。

TNBC是一种侵袭性乳腺癌亚型，其肿瘤微环境 (TME)中富含较高水平的浸润免疫细胞。已有研究表明较高的肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)水平可以预测化疗响应，因此化疗与以PD-1/ PD-L1抑制剂为代表的ICB免疫治疗组合成为十分有前景的治疗方案。多项临床试验已表明PD-1抑制剂派姆单抗联合化疗在TNBC治疗中的有效性，FDA也因此批准该联合用药方案用于早期和晚期TNBC患者的治疗。然而目前只有少数患者能够从该治疗方案中受益，而开发预测有效响应生物标志物的研究仍处于起步阶段。实际上，PD-L1在免疫细胞中的表达水平是目前唯一确定的能够指示ICB有效响应的生物标志物。然而由于未知原因，该标志物可以预测转移性TNBC对ICB的响应，但不能预测原发性TNBC对ICB的响应。

解析化疗和ICB之间决定该联合用药方案的有效响应和临床获益的复杂相互作用是一项长期挑战。在众多研究思路中，详细分析与临床响应相关的治疗前和治疗后的配对组织样本，成为推动该领域向前发展的最有前景的研究。在本期《Cancer Cell》发表的研究论文中，Zhang等人聚焦于TNBC患者中的免疫细胞，对22例接受紫杉醇单药化疗或紫杉醇化疗联合anti-PD-L1抗体阿替利珠单抗（atezolizumab）免疫治疗的晚期TNBC患者的活检样本进行单细胞RNA-seq和ATAC-seq（Zhang et al., 2021）。该研究通过解析基线水平的细胞比例（Pi指数）及治疗作用下的细胞比例变化（Ti指数）与临床响应的关联，将重点放到鉴定能够预测或介导化疗及联合治疗早期响应的关键免疫细胞类群。

该研究的一个主要发现是，与紫杉醇单药治疗相比，联合用药治疗后高表达CXCL13的CD4+ 和CD8+ T细胞比例的增加与联合治疗的有效响应有关，该发现与近期一项研究表明在原发性TNBC术前经过anti-PD-1治疗后CD8+ CXCL13+ T 细胞增加的结论一致（Bassez et al., 2021)，并且与最近报道的包括CXCL13在内的一组“炎症表型”基因与anti-PD-1免疫治疗良好响应有关的结论一致（Hammerl et al., 2021）。通过使用T细胞受体 (TCR) 测序追踪这些细胞的克隆起源，作者发现联合治疗后大部分扩增的 CXCL13+ T细胞是预先存在的克隆，而不是新浸润的细胞群，该发现也与之前的观察结果一致（Bassez et al., 2021）。值得注意的是，Zhang等人在外周血中并未发现循环CXCL13+ T细胞，而对联合治疗有响应的患者表现出循环CD8+ 效应记忆T细胞的增加，且这些细胞与TME中CD8+ CXCL13+ T细胞共享 TCR克隆。

Zhang等人同时发现基线时较高水平的B淋巴细胞能够预测紫杉醇单药及其与atezolizumab 联合的有效响应。此外，在对联合治疗有响应的患者中，CD19+ B细胞的比例选择性增加。在CD19+ B细胞群中，滤泡B淋巴细胞(Bfoc)是与ICB响应最相关的亚群。值得注意的是，CD4+ CXCL13+和CD8+ CXCL13+ T细胞均与 Bfoc在细胞比例上呈现出相关性，而Bfoc高度表达CXCL13的受体CXCR5。此外，Bfoc和CXCL13+ T细胞在组织样本中存在共定位，会形成类似三级淋巴结构 (TLS) 的聚集体，而TLS正日益成为与ICB响应有关的潜在重要标志物。最后，对T细胞和B细胞亚群中“配体-受体对”表达的相关性分析（如CD40L-CD40），进一步支持这些细胞群之间的相互关系。

该研究发现，髓系细胞中的树突状细胞 (DC)，包括cDC1和成熟DC (mDC)，在对联合治疗有响应的患者中选择性增加，而在对紫杉醇单药有响应的患者中下降，表明这些DC亚群对ICB有效响应的潜在贡献。此外，cDC1/mDC与CD4+/CD8+ CXCL13+ T细胞在细胞比例的动态变化上表现出高度相关性，因此作者提出这些DC亚群可能参与了CXCL13+ T细胞的激活（图1）。此外，尽管巨噬细胞总比例在对联合治疗无响应的TME中较高，但特定巨噬细胞亚群，包括高表达CXCL9和CXCL10的“促炎性”CCL2+和MMP9+巨噬细胞类群，与 CXCL13+ T细胞相关，并且其基线水平与联合治疗的有效响应相关。

 

图1 ICB治疗后TNBC免疫微环境的演变与激活

Zhang等人还分析了紫杉醇单药治疗后免疫细胞类群的变化，包括有响应患者中CXCL13+ T 细胞比例降低、“促炎性”巨噬细胞减少及免疫抑制性巨噬细胞增加。作者提出，这些变化可能反映了紫杉醇方案对ICB治疗的拮抗作用。然而，在解释紫杉醇（或紫杉醇方案给药时所需的类固醇药物）对ICB响应有拮抗作用时需要谨慎。首先，一项评估化疗+anti-PD-1（pembrolizumab）联合治疗用于晚期TNBC患者的关键临床试验表明，紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇和其他普遍应用的化疗药物具有同等疗效（Cortes et al., 2020）；其次，在anti-PD-1抗体帕博利珠单抗+化疗用于早期TNBC的临床试验中也使用了紫杉醇（与卡铂一起），该试验证明了联合用药方案的有效性（Schmid et al., 2020）；最后，Zhang等人的研究中使用的atezolizumab是一种PD-L1（而不是 PD-1）抑制剂，但目前尚不清楚为什么两种治疗方案会根据联合使用的化疗药不同而表现出如此不同的治疗效果。目前临床上正在开发化疗与其他PD-L1抑制剂联合使用治疗TNBC的方案（Loibl et al., 2021）。

虽然对紫杉醇治疗效应的解释有这些注意事项，Zhang等人的详细工作为免疫系统在anti-PD-L1联合化疗时的激活途径提供了一个有趣的模型（图 1）。他们的数据表明，CD19+ B 细胞激活CD4+ CXCL13+ T细胞，而CD4+ CXCL13+ T细胞又通过cDC1辅助激活CD8+ CXCL13+ T细胞。外周血中CD4+/CD8+ CXCL13+ T细胞和cDC1的缺失暗示了局部肿瘤免疫表型可能不一定反映全身免疫特征的观点。尽管如此，近期许多研究指出了全身免疫系统对ICB响应的重要性，证明了循环单核细胞在黑色素瘤中对ICB的有效响应（Krieg et al., 2018)，及循环CD4+ T细胞在小鼠模型中的抗肿瘤作用（Spitzer et al., 2017）。此外，肿瘤引流淋巴结（TDLN）也被认为是ICB有效响应的重要参与者，其可能是激活全身免疫反应的部位。实际上，Zhang等人发现在荷瘤淋巴结中富集的初始状态T细胞亚群 (Tn-LEF1)，可以预测对联合治疗的有效响应。总体来说，这些发现暗示了识别基于血液的标志物以预测和监测免疫治疗有效响应的令人兴奋的未来潜力。

Zhang等人的综合分析作为前瞻性的代表，此类研究将推动肿瘤免疫领域向前发展。值得注意的，该研究存在一定的局限性：包括分析接受紫杉醇单药（原发性乳腺肿瘤）与联合治疗（转移部位）患者的不同肿瘤部位、基于相关性的分析本质，以及使用短期终点（8周时的响应）可能无法完全捕捉与ICB长期疗效相关的特征。未来的相关研究还应结合更详细的绝对细胞数量指标以及对其他细胞群的分析，包括肿瘤细胞和癌症相关基质细胞等。然而，在肿瘤免疫治疗全面复兴但仍存在有待解决的关键问题的前提下，Zhang等人的研究基于免疫治疗临床队列数据进行无偏性综合分析，无疑将产生关于细胞类型、功能通路和可望实验测试和验证的潜在生物标志物的有用假设。

相关链接：

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(21)00601-2

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(21)00499-2

参考文献：

1. Bassez et al. A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer. Nat. Med. 2021; 27: 820-832

2. Cortes et al. Pembrolizumab plus chemotherapy versus placebo plus chemotherapy for previously untreated locally recurrent inoperable or metastatic triple-negative breast cancer (KEYNOTE-355): a randomised, placebo-controlled, double-blind, phase 3 clinical trial. Lancet. 2020; 396: 1817-1828

3. Hammerl et al. Spatial immunophenotypes predict response to anti-PD1 treatment and capture distinct paths of T cell evasion in triple negative breast cancer. Nat. Commun. 2021; 12: 5668

4. Krieg et al. High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy. Nat. Med. 2018; 24: 144-153

5. Loibl et al. Durvalumab improves long-term outcome in TNBC: results from the phase II randomized GeparNUEVO study investigating neodjuvant durvalumab in addition to an anthracycline/taxane based neoadjuvant chemotherapy in early triple-negative breast cancer (TNBC). J. Clin. Oncol. 2021; 39: 506

6. Schmid et al. Pembrolizumab for Early Triple-Negative Breast Cancer. N. Engl. J. Med. 2020; 382: 810-821

7. Spitzer et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 2017; 168: 487-502.e15

8. Zhang et al. Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancer. Cancer Cell. 2021; 39 (S1535-6108(21)00499-2)