先天性糖基化障碍的新病因

　　

先天性糖基化障碍（CDG，以前称为碳水化合物缺乏糖蛋白综合征）是一个快速增长的遗传性疾病家族，影响糖缀合物上聚糖的组装或加工。迄今为止发现的不同类型CDG的临床谱各不相同，从严重的多系统疾病到局限于特定器官的疾病。

本文通过新一代测序（NGS）分析人类患者血液样本确定了一种由第二起始蛋氨酸（p.M55V）中的单一错义替换引起的疾病类型，导致短亚型完全丧失。患者患有早期致命的多系统疾病，包括严重肝病、骨骼异常和糖基化异常。

先天性糖基化障碍疾病典型的血清筛查试验包括血清转铁蛋白糖链分析，N和O聚糖分析，为了进一步了解异常的N-聚糖结构，采用MALDI-TOF质谱法对二甲基化聚糖进行血浆N-聚糖谱分析 。用PNGaseF孵育过夜来切割多聚糖，再用石墨化碳SPE柱纯化过甲基化，干燥后的聚糖新悬浮在甲醇/醋酸钠混合物中进行斑点测定，然后在AB SCIEX 5800 MALDI TOF/TOF（SCIEX）上进行测量。10μl血清或血浆样本用抗Tf 珠子孵育，利用微流控纳米LC-C8芯片6540 QTOF仪器分析洗脱液，再由安捷伦（Agilent）6540 nanochip QTOF上进行完整的转铁蛋白的高分辨率质谱分析，数据分析采用安捷伦Mass Hunter Qualitative Analysis Software B.04.00，对于电荷分布原始数据的反褶积，使用了安捷伦BioConfirm软件。

通过电子显微镜观察异常的蛋白糖基化提示高尔基体运输缺陷后，进行染色体微阵列分析，在所有三个受影响的同胞（（IV:8、IV:9和IV:10）中，11号染色体上有几个纯合区域。对IV:9进行外显子组测序，以发现可能与该疾病相关的遗传变异。外显子组测序使用使用Qiagen微型试剂盒（Qiagen）从患者IV:9的成纤维细胞中提取基因组DNA，并在琼脂糖凝胶上检查DNA降解情况。外显子组富集使用安捷伦SureSelect Human All Exon 50 Mb试剂盒，覆盖约21000个基因。利用SOLiD 5500xl sequencer获得外显子组文库，SOLiD LifeScope software version 2.1软件将颜色空间读书迭代映射到hg19参考基因组，对调用的变体和INDEL进行注释，根据dbSNP中>0.5%的频率和内部数据库>5000个外显子中>0.3%的频率筛选出常见变体。应用质量标准筛选出变异读数小于5且变异小于20%的变异，同义变异、深内含子、基因间和UTR变异已被排除在外。此外，Sanger测序证实，所有受影响个体（IV:8、IV:9和IV:10）均为纯合子，母亲（III:2）均为杂合子。父系DNA无法用于检测。

从这几位患者分离的原代人真皮成纤维细胞显示糖基化缺陷；电子显微镜观察到高尔基体形态改变；糖基转移酶错误定位；以及内质网-高尔基体运输受损。

基于Stx5（RUSH系统）和Förster共振能量转移（FRET）的生物素同步形式的同源结合SNAREs的测量结果表明，Stx5的短亚型对于高尔基体内运输至关重要。因此，Stx5的替代起始密码子与人类疾病有关，表明翻译起始位点是调节蛋白质运输的重要新概念。

这项研究发现了CDG的一个新病因，Stx5中替代翻译起始位点的突变影响细胞内膜运输，会导致CDG。虽然之前有关于导致疾病的替代起始位点变异的描述，但这项研究表明，导致亚型丢失的替代起始密码子突变也可导致疾病。

Congenital disorder of glycosylation caused by starting site-specific variant in syntaxin-5